董 偉， 李由然， 張 梁， 丁重陽， 石貴陽*

（1. 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

蛋氨酸作為一種含硫氨基酸被廣泛應(yīng)用于飼料添加，食品制造，生物制藥等領(lǐng)域[1-3]，目前，蛋氨酸的生產(chǎn)仍然停留在利用化石燃料通過化工合成的辦法滿足市場需求， 對生態(tài)環(huán)境造成很大壓力。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-蛋氨酸因其低成本與環(huán)境友好型等特點(diǎn)，受到越來越多專家學(xué)者的親賴。 通過隨機(jī)誘變和代謝工程可以選育蛋氨酸高產(chǎn)菌株，但前者不確定性較強(qiáng)，工作量較大。 隨著全基因組測序技術(shù)和系統(tǒng)代謝工程的日趨成熟，使理性改造菌株發(fā)酵生產(chǎn)蛋氨酸成為代謝合成研究的熱點(diǎn)[4]。

目前，微生物代謝工程改造增強(qiáng)蛋氨酸合成主要通過加強(qiáng)蛋氨酸合成酶編碼基因metB[5-6]、S-腺苷甲硫氨酸合成酶編碼基因metK[7]、解除反饋抑制的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀?；窰TSFbr[8]和高絲氨酸琥珀?；D(zhuǎn)移酶編碼基因metA[9]的表達(dá)等方式來增強(qiáng)碳代謝途徑，敲除MetJ 阻遏蛋白編碼基因metJ、MetD 運(yùn)輸系統(tǒng)的編碼基因metNIQ、賴氨酸合成途徑編碼基因lysA 和蘇氨酸合成途徑編碼基因thrC 等方式阻斷支路降解途徑，同時(shí)也有關(guān)于硫代謝途徑和葡萄糖運(yùn)輸途徑修飾相關(guān)的研究報(bào)道[10,11]。微生物代謝合成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，為了避免代謝流流向一些未知的支路途徑和減少胞內(nèi)氨基酸的過量積累對菌體生長造成負(fù)擔(dān)，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)成為一些研究者關(guān)注的重點(diǎn)，如本研究室曾發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對蘇氨酸代謝合成起到非常重要的作用[11]。大腸桿菌蛋氨酸MetD吸收轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)編碼基因metN、metI 和metQ 的全部敲除可以降低E.coli W3110 胞外蛋氨酸的吸收速率，YjeH 和YeaS 分泌系統(tǒng)可以加強(qiáng)蛋氨酸向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)，但目前并沒有將兩者相結(jié)合進(jìn)行胞外蛋氨酸積累影響的報(bào)道[12]。

本研究中以E.coli W3110 為出發(fā)菌株，通過比較metN、metI 和metQ 單基因敲除菌株與metN、metI 和metQ 的全部敲除菌株胞外蛋氨酸吸收速率， 選擇胞外吸收速率最小的菌株進(jìn)行YjeH 和YeaS 分泌系統(tǒng)研究，闡述弱化蛋氨酸吸收與增強(qiáng)蛋氨酸分泌集成改造策略對胞外蛋氨酸積累的影響。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 本研究中所用的基座菌株E.coli W3110 為實(shí)驗(yàn)室保藏， 基因敲除所需要的質(zhì)粒pKD13、pKD46、pCP20 購于美國耶魯大學(xué)大腸桿菌菌 株 庫 （CGSC，E.coli Genetic Stock Center，New Haven，USA）[12]。 實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保藏的質(zhì)粒pETABY， 由pN25 啟動(dòng)子控制蛋氨酸操縱子編碼框pET-ABY 的表達(dá)，metA、metB、malY 分別編碼高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶、γ-胱硫醚聚合酶、β-胱硫醚酶。重 組 菌M10、M11、M12、M13、M14、M15、M16 為 本研究構(gòu)建，各菌株及質(zhì)粒見表1。

表1 本研究中主要的菌株和質(zhì)粒Table 1 Main strains and plasmids used in this study

1.1.2 工具酶及試劑 實(shí)驗(yàn)所用的RNA 提取試劑盒、2×taq PCR master mix、 質(zhì)粒DNA 提取試劑盒，購自杭州寶賽生物公司；胰蛋白胨、瓊脂粉、酵母粉，購自英國Oxoid 公司；瓊脂糖，購自Biowest 公司；氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素，購自Sigma 公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

續(xù)表1

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 SOB 培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉5，KCl 0.186，MgCl20.95，NaCl 0.5，蛋白胨20；轉(zhuǎn)接攜帶有質(zhì)粒pKD46 的液體SOB 培養(yǎng)基需另加入7.5 g/L L-阿拉伯糖。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為改進(jìn)的TPM 培養(yǎng)基（g/L）[13]：維 生 素B120.01， 葡 萄 糖 20，MgSO4·7H2O 2，MnSO4·4H2O 0.5， 酵母粉4，KH2PO44，（NH4）2SO414，L-threonine 0.238，L-lysine 0.164，CaCO310，PLP 0.01，生物素0.01，微量元素母液5 mL。 微量元素母液成份（g/L）：CuSO4·5H2O 1，CaCl21.35，Na2B4O7·10H2O 0.23，ZnSO4·7H2O 2.25，F(xiàn)eSO4·7H2O 10， （NH4）6Mo7O24·4H2O 0.106，35 g/dL HCl，10 mL， 調(diào)整最終pH 為7.0。接種體積分?jǐn)?shù)2%，31°C、250 r/min 搖床培養(yǎng)48 h。

分析培養(yǎng)基（g/L）：蛋氨酸0.5，H3BO31，MgSO42.05，MnSO420，（NH4）2SO40.75，NH4Cl 0.13，F(xiàn)eSO440，CaCl240，CoCl28，（NH4）2HPO42，ZnSO44，CuCl22，（NH4）2Mo2O72.8，Na2HPO42，K2HPO44，調(diào)整最終pH 6.7。

1.1.4 引物

表2 本實(shí)驗(yàn)所用引物Table 2 Oligonucleotides used in this study

續(xù)表2

1.2 方法

1.2.1 基因敲除和基因組替換方法 利用Red 重組技術(shù)進(jìn)行基因敲除[14]。1）PCR 打靶片段的制備：質(zhì)粒pKD13 作為模版， 以InmetQ-FW/InmetQ-RV、InmetI-FW/InmetI-RV、InmetN-FW/InmetN-RV為引物，2×taq聚合酶擴(kuò)增片段大小為1.4 kb 的敲除盒metQ、metI、metN。PCR 擴(kuò)增體系10 μL，2×PCR master mix 5 μL，ddH2O 4.7 μL，模板0.1 μL，引物各0.1 μL。2）突變盒的純化濃縮：PCR 反應(yīng)產(chǎn)物凝膠電泳純化后所得片段中加入1/50 倍體積5 mol/L NaCl和2 倍體積預(yù)冷的無水乙醇，于-70 ℃冰箱靜置20 min，取出后4 ℃、12000 r/min 離心10 min，去除上清液后得到黏附于管壁的絮狀沉淀，加入無水乙醇（預(yù)冷），4 ℃、12000 r/min 離心4 min， 用適量ddH2O振蕩溶解。 3）基因敲除：制備含有質(zhì)粒pKD46 的E.coli感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)體系為：感受態(tài)細(xì)胞，95 μL；突變盒片段，5 μL；電壓，1800 V；后培養(yǎng)37 °C，1 h。以YmetQ-FW/YmetQ-RV、YmetI-FW/YmetI-RV、YmetN-FW/YmetN-RV 作為引物進(jìn)行PCR 驗(yàn)證。4）卡那霉素抗性的消除：制備整合了敲除盒的E.coli菌株的感受態(tài)細(xì)胞，通過電激轉(zhuǎn)化導(dǎo)入質(zhì)粒pCP20，利用含有氯霉素抗性的SOB 固體平板進(jìn)行篩選，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR 驗(yàn)證。

基因組上整合替換，所用引物見表2。打靶片段的制備參見文獻(xiàn)[15]。 利用Red 重組在E.coliW3110染色體上單拷貝整合yjeH、yeaS。

1.2.2 菌體生長曲線的測定 分別挑取E. coliW3110、M11、M12、M13 的單菌落于20 mL SOB 液體培養(yǎng)基，37 °C、200 r/min 過夜培養(yǎng)， 轉(zhuǎn)接50 mL FM 培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)，每隔2 h 取樣檢測分光光度計(jì)600 nm 下的菌體密度，測定生長曲線。

1.2.3 菌體生物量的測定 菌體濃度以分光光度計(jì)600 nm 下的吸光值OD600表示，菌體干重（DCW）以本實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)公式換算獲得：

DCW=OD600×0.3809-0.0048[12]

1.2.4 蛋氨酸的測定 HPLC 柱前鄰苯二醛（OPA）自動(dòng)衍生法測定蛋氨酸的濃度，Waters C18(250 mm×4.6 mm，0.5 μm) 反相柱分離，A、B 流動(dòng)相梯度洗脫，洗脫程序如表3 所示，柱溫40 ℃，紫外檢測器檢測，檢測波長338 nm。

表3 HPLC 蛋氨酸分析洗脫程序Table 3 Gradient elution for analysis of L-methionine by HPLC

1.2.5 熒光定量PCR （RT-qPCR） 利用試劑盒提取大腸桿菌總的RNA，qPCR CT 值的校正以引物pf-16S，pr-16S 擴(kuò)增16SrRNA 作為內(nèi)參基因， 相對表達(dá)量以2-△△CT模型進(jìn)行檢測[16]，所用引物見表2。

1.2.6 蛋氨酸胞內(nèi)運(yùn)輸能力檢測 SOB 培養(yǎng)基中添加0.5 g/L 蛋氨酸作為種子培養(yǎng)基， 過夜培養(yǎng)，誘導(dǎo)菌株表達(dá)蛋氨酸吸收載體。 在蛋氨酸分析培養(yǎng)基中添加1 g/L 的蛋氨酸作為碳源， 發(fā)酵過程中檢測菌體生長過程中蛋氨酸的消耗情況，以蛋氨酸對菌體的比消耗速率表征大腸桿菌吸收蛋氨酸的能力。

2結(jié)果與分析

2.1 MetD 運(yùn)輸系統(tǒng)缺失菌株的構(gòu)建

以E. coliW3110 為出發(fā)菌株， 按照1.2.1 的方法敲除metN、metI、metQ，構(gòu)建菌株M11、M12、M13，結(jié)果如圖1 所示。metN、metI、metQ的鑒定引物分別為YmetN-FW/YmetN-RV、YmetI-FW/YmetIRV、YmetQ-FW/YmetQ-RV，利用2 對引物與K1、K2 對敲除菌株進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證，得到990、740、1170 bp 和1170、1420、1090 bp 的PCR 片段，電泳結(jié)果與理論值相符，消除kan抗性后，得到850、880、950 bp 的DNA 片段，送生工測序結(jié)果正確，成功構(gòu)建了metN、metI、metQ基因敲除菌株。

2.2 弱化蛋氨酸吸收基座菌株的篩選

圖1 metN、metI、met 突變轉(zhuǎn)化子的PCR 鑒定Fig. 1 PCR identification of metN, metI, metQ gene mutants

按照1.2.6 的方法對大腸桿菌W3110 和重組菌株M11、M12、M13 蛋氨酸吸收能力進(jìn)行了檢測。 圖2 表示搖瓶培養(yǎng)10 h 菌體的生長以及培養(yǎng)基中蛋氨酸質(zhì)量濃度的變化，表4 列出了重組菌株蛋氨酸的比消耗速率。 由圖2 可知，在蛋氨酸分析培養(yǎng)基中重組菌與對照菌株均生長緩慢，但是對蛋氨酸的消耗速率顯著差異。 由表4 可知， 搖瓶培養(yǎng)10 h，metN、metI、metQ 基因單敲除菌株M11、M12、M13 蛋氨酸平均比消耗速率分別為11.23、10.34、12.03 mg/（L·h），與對照菌W3110 相比蛋氨酸的平均比消耗速率分別降低了9.5%、16.7%、3.1%。 metI 基因的敲除顯著降低了大腸桿菌對于胞外蛋氨酸的吸收效率，metN 次之；敲除基因metQ，蛋氨酸吸收能力降低幅度最小。 本研究室前期研究發(fā)現(xiàn)，metNIQ 三敲除菌株胞外蛋氨酸吸收速率降低了13.4%[12]， 基因metI 單敲除更加有利于減少大腸桿菌對胞外蛋氨酸的重吸收。 因此，本研究將M12 作為弱化蛋氨酸吸收基座菌株與蛋氨酸分泌系統(tǒng)相結(jié)合進(jìn)行集成改造，考察胞外蛋氨酸的積累。

表4 重組菌株蛋氨酸吸收能力Table 4 L-methionine uptake capacity of strains with MetD modified transport system

圖2 蛋氨酸分析培養(yǎng)基中重組菌株生長狀況Fig. 2 Growth status of recombinant strains in methionine assay medium

2.3 YjeH，YeaS 運(yùn)輸系統(tǒng)游離表達(dá)對菌株生長以及蛋氨酸胞外積累的影響

圖3 重組菌株E. coli M12、M12（pET-ABY）、M12（pETABY /pKK-yjeH）、M12 （pKK-yjeH）、M12 （pKKyeaS）、M12（pET-ABY /pKK-yeaS）生長曲線Fig. 3 Growth curves of recombinant strains E.coli M12，M12(pET-ABY)，M12(pET-ABY/pKK-yjeH)，M12(pKK-yjeH)，M12(pKK-yeaS) and M12(pET-ABY/pKK-yeaS)mutants

將實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的yjeH、yeaS 基因過表達(dá)載體pKK-yjeH、pKK-yeaS 轉(zhuǎn)染M12， 記錄菌體生長以及胞外蛋氨酸積累情況。從圖3 可以看出yjeH 與yeaS 的過表達(dá)在一定程度上均抑制了菌體的生長，本研究室前期構(gòu)建用來表達(dá)解除了反饋抑制的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀?；负驮鰪?qiáng)蛋氨酸代謝過程中的γ-胱硫醚聚合酶以及β-胱硫醚酶[12]的質(zhì)粒pETABY 的表達(dá)可以有效緩解生長抑制。 yjeH、yeaS 的過量表達(dá)可能使大腸桿菌胞內(nèi)蛋氨酸質(zhì)量濃度過低， 影響了大腸桿菌生長過程中所需要物質(zhì)的合成，菌體的生長受到抑制，同時(shí)胞外蛋氨酸的質(zhì)量濃度過高也會(huì)抑制菌體的生長， 質(zhì)粒pET-ABY 的表達(dá)強(qiáng)化了蛋氨酸合成途徑，在基因交互作用的影響下其生長抑制得到了有效緩解。 對比M12（pETABY）、M12 （pET-ABY/pKK-yjeH） 和M12 （pETABY/pKK-yeaS）發(fā)酵過程中胞內(nèi)蛋氨酸的質(zhì)量濃度變化，如圖4 所示，YjeH、YeaS 運(yùn)輸系統(tǒng)的強(qiáng)化促進(jìn)了大腸桿菌向胞外分泌L-蛋氨酸， 降低了胞內(nèi)L-蛋氨酸的積累，YjeH 運(yùn)輸系統(tǒng)的效果更為顯著。 我們對2 種轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)游離表達(dá)菌株進(jìn)行了發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5 所示，YjeH 與YeaS 運(yùn)輸系統(tǒng)的表達(dá)都能夠在胞外積累一定量的蛋氨酸， 其最大積累量分別為0.21 g/L 和0.18 g/L，蛋氨酸產(chǎn)率分別為0.06 g/g DCW 和0.05 g/g DCW。

圖4 重組菌株發(fā)酵過程中胞內(nèi)蛋氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig. 4 Intracellular methionine concentration during fermentation of recombinant strains

2.4 YjeH 和YeaS 在染色體上的整合表達(dá)

metJ為大腸桿菌蛋氨酸代謝過程中的關(guān)鍵阻遏基因， 其通過與代謝過程中關(guān)鍵基因metK、metQIN、metF、metC、metE、metBL和metR等啟動(dòng)子的Met-box 相結(jié)合來影響蛋氨酸代謝通路，為了降低SAM 和metJ的共阻遏效應(yīng)， 我們通過敲除編碼基因metJ構(gòu)建解除阻遏調(diào)控的重組菌株[17-20]。 構(gòu)建打靶質(zhì)粒T-metJPtacM[15]，通過電激轉(zhuǎn)化的方法，在E. coliW3110 染色體上敲除metJ基因并單拷貝整合yjeH和yeaS基因， 一步實(shí)現(xiàn)metJ的敲除和yjeH、yeaS在染色體上的整合表達(dá)。 以W3110 染色體為模板，用引物YjeH-SmaI-FW/YjeH-HindIIIRV、YeaS-SmaI-FW/YeaS-HindIII-RV PCR 擴(kuò)增yjeH，yeaS，將所得到的基因片段，與經(jīng)過HindIII，SmaI 酶切處理過的載體T-metJPtacM 連接， 酶切得到大小分別為1257 bp/5059 bp 和639 bp/5059 bp的片段如圖6（a）、6（c）所示，測序結(jié)果無堿基突變，說明載 體T-metJPtacMyjeH，T-metJPtacMyeaS構(gòu) 建 成功。按照1.2.1 的方法將metJPtacMyjeH，metJPtacMyeaS整合到W3110 的染色體上，構(gòu)建菌株M15、M16，鑒定結(jié)果如圖6（b）、6（d）所示。

圖5 重組菌M12 （pKK-yeaS/pET-ABY）、M12 （pKKyjeH/pET-ABY）搖瓶發(fā)酵生長代謝狀況Fig. 5 Growth and metabolism of recombinant M12 （pKK-yeaS/pET-ABY） and M12 （pKKyjeH/pET-ABY） during shake flask fermentation

2.5 YjeH 運(yùn)輸系統(tǒng)整合表達(dá)對菌株生長以及蛋氨酸胞外積累的影響

利用RT-qPCR 比較了菌株M15 相對于野生E. coliW3110yjeH和yeaS基因的表達(dá)比率， 結(jié)果如圖7 所示，與原始菌株相比，yjeH、yeaS基因的表達(dá)水平分別提高了1.65 倍和1.59 倍。對M15（pETABY）和M16（pET-ABY）進(jìn)行了發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證基因yjeH、yeaS整合表達(dá)對蛋氨酸胞外分泌的影響，如圖8 所示，M15（pET-ABY）和M16（pET-ABY）最大胞外蛋氨酸的積累量分別為0.48 g/L 和0.25 g/L，蛋氨酸產(chǎn)率分別為0.13 g/g DCW 和0.08 g/g DCW。與游離表達(dá)相比， 其產(chǎn)量分別提高了128%和38.9%，產(chǎn)率提高了85.7%和60%。

圖6 菌株M15，M16 的PCR 鑒定電泳圖Fig. 6 PCR identification of strain M15 and M16

圖7 不同菌株yjeH 轉(zhuǎn)錄水平測定Fig. 7 Relative gene transcriptional levels of yjeH in the different strain

圖8 重組菌M15（pET-ABY）、M16（pET-ABY）搖瓶發(fā)酵生長代謝狀況Fig. 8 Growth and metabolism of recombinantM15 （pETABY） and M16 （pET-ABY） during shake flask fermentation

3結(jié) 語

隨著對微生物氨基酸合成途徑的深入了解，轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在氨基酸育種研究中的作用越來越受到人們的重視，近年來的研究表明，對氨基酸向胞內(nèi)吸收和胞外運(yùn)輸途徑進(jìn)行改造，是提高氨基酸產(chǎn)量行之有效的方法。MetD 運(yùn)輸系統(tǒng)是蛋氨酸吸收的主要途徑，與過表達(dá)代謝途徑中促進(jìn)蛋氨酸合成的關(guān)鍵酶相比，修飾蛋氨酸向胞內(nèi)的運(yùn)輸系統(tǒng)并不能提高蛋氨酸生物合成代謝流，但能夠有效減少組織對胞外蛋氨酸的吸收，降低胞內(nèi)蛋氨酸的濃度，改善內(nèi)部環(huán)境，從而減弱蛋氨酸對細(xì)胞的毒害作用以及降低無效循環(huán)，進(jìn)而可以提高魯棒性以及氨基酸合成的能力[12]。 本實(shí)驗(yàn)以E. coli W3110 為基座菌株，利用Red 重組技術(shù)分別獲得E. coli W3110 中MetD運(yùn)輸系統(tǒng)的關(guān)鍵組分metN、metI 和metQ 單敲除菌株， 與菌株W3110 相比，metI 的缺失使胞外蛋氨酸吸收速率降低了16.7%。 為了避免多拷貝引起的轉(zhuǎn)基因沉默以及基因表達(dá)水平過高抑制菌體生長，對M12 進(jìn)行yjeH 和yeaS 基因單拷貝整合有效促進(jìn)了胞外蛋氨酸的積累，同時(shí)緩解了游離表達(dá)造成的菌體生長抑制現(xiàn)象，M15 （pET-ABY） 和M16 （pETABY） 最大胞外蛋氨酸產(chǎn)量分別提高了128%和38.9%。 可見，在弱化蛋氨酸吸收基座菌株的基礎(chǔ)上加強(qiáng)胞內(nèi)蛋氨酸的分泌進(jìn)行集成改造可以有效提高胞外蛋氨酸的積累。 盡管很多研究人員分別進(jìn)行氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)分泌系統(tǒng)和吸收系統(tǒng)的研究，但將兩者有機(jī)結(jié)合進(jìn)行系統(tǒng)的分析改造是轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)工程研究的重要趨勢，在以后蛋氨酸以及其他氨基酸生產(chǎn)菌株的理性改造過程中必將發(fā)揮愈來愈重要的作用。