姬名碩，王曉東，美日哈巴·阿西木，張麗娟，夏日克亞·玉素甫江，帕麗達(dá)·阿布利孜

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830054

近年來，侵襲性真菌感染(IFI)患者逐年增多，目前已成為許多疾病致病和致死的重要病因[1]。盡管IFI的診斷技術(shù)和治療手段取得了一定的進(jìn)展，但侵襲性曲霉菌病患者經(jīng)治療后病死率仍>50%[2,3]。近年來，IFI的真菌譜也在發(fā)生變化，以往常見的白色念珠菌感染呈下降趨勢(shì)[4]，而以往不常見的曲霉菌感染比例上升[5]。新的曲霉菌株也不斷出現(xiàn)，比如曲霉屬的新種A.lentulus、A.udagawae、A.viridinutans、A.thermomutatus。在這些新曲霉菌中，文獻(xiàn)報(bào)道最多的就是煙曲霉菌的姊妹菌A.lentulus，然而目前對(duì)該菌的毒力、流行率和發(fā)病機(jī)制尚不清楚[6]。為探究A.lentulus的毒力，我們把1例慢性阻塞性肺疾病(COPD)老年男性患者痰標(biāo)本中分離出的A.lentulus為觀察對(duì)象，并以A.lentulus標(biāo)準(zhǔn)菌株、煙曲霉菌、白色念珠菌作對(duì)照，將各菌株分別感染蠟螟幼蟲，并比較蠟螟幼蟲的生存率、黑色素化、活動(dòng)度，旨在評(píng)價(jià)A.lentulus的毒力強(qiáng)弱，為探索更有效的IFI治療方法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源、培養(yǎng)、分離及菌懸液配置A.lentulus患者菌株(菌號(hào)：XYZ 10188，由2011年新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的1例患有5年COPD的老年男性患者痰標(biāo)本中分離)、A.lentulus標(biāo)準(zhǔn)菌株(菌號(hào)：XYZ 10192)、煙曲霉菌(菌號(hào)：XYZ10110)、白色念珠菌(菌號(hào)：XYZ9013)均來自新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科實(shí)驗(yàn)室。上述各菌分別接種在MEA 9 cm培養(yǎng)皿中，37 ℃培養(yǎng)生長(zhǎng)。A.lentulus培養(yǎng)9 d(本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示A.lentulus9 d后毒力較強(qiáng))，煙曲霉菌、白色念珠菌培養(yǎng)4 d，之后開始配制菌懸液。每株菌用滅菌的10 μL的PBS液進(jìn)行3次的菌苔洗脫。用干凈棉棒輕輕擦拭菌落表面，盡可能多的將菌落中孢子洗脫至PBS中，用移液器將菌液轉(zhuǎn)入帶有玻璃棉的注射器過濾到收集管中。用白細(xì)胞計(jì)數(shù)板(25×16型計(jì)數(shù)板)在顯微鏡下計(jì)數(shù)孢子數(shù)量，并計(jì)算菌液濃度，孢子數(shù)/mL=80個(gè)小格的孢子總數(shù)/80×400×10 000×稀釋倍數(shù)，得到濃度除以所需要的濃度即為稀釋倍數(shù)，稀釋后的菌液即為所得濃度。

1.2 蠟螟幼蟲分組、菌株注射方法及蠟螟幼蟲生存、體表黑色素化、活動(dòng)度觀察 選取體表顏色發(fā)白的蠟螟幼蟲70只，并分為7組，均給予400 μL相應(yīng)菌株或PBS，A組每只蠟螟幼蟲右側(cè)尾足處注射1×104CFU的A.lentulus患者菌株，B組每只注射1×105CFU的A.lentulus患者菌株，C組每只注射1×106CFU的A.lentulus患者菌株，D組每只注射1×106CFU的A.lentulus標(biāo)準(zhǔn)菌株，E組每只注射1×106CFU的煙曲霉菌，F(xiàn)組每只注射1×106CFU的白色念珠菌，G組每只注射PBS。每組中的每個(gè)菌測(cè)試10只蠟螟幼蟲，每5只蠟螟幼蟲分別分裝在2個(gè)鋪有濾紙的9 cm的干凈培養(yǎng)皿中備用。將各組蠟螟幼蟲放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，記錄感染0、2、18、24、48、72 h蠟螟幼蟲的生存率，參照文獻(xiàn)[7,8]的體表黑色素化及活動(dòng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)上述各時(shí)點(diǎn)蠟螟幼蟲的體表黑色素化情況及活動(dòng)度。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)點(diǎn)蠟螟幼蟲生存率 不同時(shí)點(diǎn)蠟螟幼蟲生存率見表1。由表1可知，A組在觀察時(shí)間段內(nèi)，0 h生存率最高，在24 h開始發(fā)生死亡，生存率降至96.67%，48、72 h生存率未發(fā)生明顯變化與24 h時(shí)相同，生存率最低(P均>0.05)。B組結(jié)果與A組相同。C組在觀察時(shí)間段內(nèi)，0 h生存率最高，在18 h開始發(fā)生死亡，生存率降至約66.67%，隨著時(shí)間的推移生存率逐漸降低，在72 h生存率最低約為20.00%(P均<0.05)。D組0 h生存率最高，在18 h開始發(fā)生死亡，生存率降至96.67%，隨著時(shí)間的推移生存率逐漸降低，在72 h生存率最低約為36.67%(P均<0.05)。E組在0 h生存率最高，在18 h開始發(fā)生死亡，生存率降至20.00%，在24 h內(nèi)全部死亡(P均<0.05)。F組在0 h生存率最高，在18 h開始發(fā)生死亡，生存率降至60.00%，在24 h內(nèi)全部死亡(P均<0.05)。G組在觀察時(shí)間段內(nèi)，在0 h生存率最高，在24 h開始發(fā)生死亡，生存率降至96.67%、隨著時(shí)間的推移生存率逐漸降低，在72 h生存率最低約為93.33%(P均>0.05)。在18、24、48、72 h，7組整體比較都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)。不同濃度A.lentulus比較，在18、24、48、72 h，A、B組比較，P均>0.05，A、C組比較，B、C組比較，P均<0.05。不同菌株間比較，在18 h時(shí)，C、D組比較，P均>0.05；24、48、72 h時(shí)，C、D組比較，P均<0.05。18、24、48、72 h，C組分別與E、F組比較，P均<0.05。在18 h時(shí)，E組與F組比較，P>0.05。18、24 h時(shí)，C、E、F組與G組比較，P均<0.05。在48、72 h，C、D、E、F組與G組比較，P均<0.05。

表1 各組不同時(shí)點(diǎn)蠟螟幼蟲生存率

2.2 各組不同時(shí)點(diǎn)蠟螟幼蟲體表黑色素化評(píng)分 不同時(shí)點(diǎn)蠟螟幼蟲體表黑色素化評(píng)分見表2。由表2可知，A組在觀察時(shí)間段內(nèi)，0 h體表黑色素化評(píng)分最高，在2 h開始下降，48 h降至最低(P均>0.05)。B組在觀察時(shí)間段內(nèi)，0 h體表黑色素化評(píng)分最高，在2 h開始下降，72 h降至最低(P均>0.05)。C組在觀察時(shí)間段內(nèi)，0 h體表黑色素化評(píng)分最高，在2 h開始下降，72 h將至最低(P均<0.05)。D組在觀察時(shí)間段內(nèi)，0 h體表黑色素化評(píng)分最高，在2 h開始下降，72 h降至最低(P均<0.05)。E組在觀察時(shí)間段內(nèi)，0 h體表黑色素化評(píng)分最高，在2 h開始下降，24 h內(nèi)蠟螟全部死亡，評(píng)分降至最低(P均<0.05)。F組在觀察時(shí)間段內(nèi)，0 h體表黑色素化評(píng)分最高，在2 h開始下降，24 h內(nèi)蠟螟全部死亡，評(píng)分降至最低(P均<0.05)。G組在觀察時(shí)間段內(nèi)，0 h體表黑色素化評(píng)分最高，在18 h開始下降至最低評(píng)分后，隨著觀察時(shí)間增加未發(fā)生變化(P均>0.05)。在0 h時(shí)，7組整體間比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。在2、18 h、24、48、72 h，7組整體比較都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)。不同濃度A.lentulus比較，在2、18、24、48、72 h，A、B組比較，P均>0.05;A、C組比較，B、C組比較，P均<0.05。不同菌株間比較，在2、18、24、48、72 h，C、D組比較，E、F組比較，P均>0.05；C組分別與E、F組比較，P均<0.05。2、18、24、48、72 h時(shí)，A、B組與G組比較，P均>0.05。在2、18 h，C、D組與G組比較，P均>0.05；在24、48、72 h，C、D組與G組比較，P均<0.05。在2、18、24、48、72 h，E、F組與G組比較，P均<0.05。

表2 各組不同時(shí)點(diǎn)蠟螟幼蟲體表黑色素化評(píng)分(分，

2.3 各組不同時(shí)點(diǎn)蠟螟幼蟲活動(dòng)度評(píng)分 不同時(shí)點(diǎn)蠟螟幼蟲活動(dòng)度評(píng)分見表3。由表3可知，A組在觀察時(shí)間段內(nèi)，活動(dòng)度評(píng)分未發(fā)生明顯變化，在0 h活動(dòng)度評(píng)分最高，在48 h開始下降至最低評(píng)分，72 h未發(fā)生變化(P均>0.05)。B組變化結(jié)果和A組類似。C組在觀察時(shí)間段內(nèi)，0 h活動(dòng)度評(píng)分最高，在2 h開始下降，72 h將至最低(P均<0.05)。D組在觀察時(shí)間段內(nèi)，0 h活動(dòng)度評(píng)分最高，在18 h開始下降，72 h降至最低(P均<0.05)。E組在觀察時(shí)間段內(nèi)，0 h活動(dòng)度評(píng)分最高，在2 h開始下降，24 h蠟螟全部死亡，評(píng)分降至最低(P均<0.05)。F組在觀察時(shí)間段內(nèi)，0 h活動(dòng)度評(píng)分最高，在2 h開始下降，18 h蠟螟全部死亡，降至最低(P均<0.05)。G組在觀察時(shí)間段內(nèi)，0 h評(píng)分最高，在18 h開始下降至最低評(píng)分后，隨著觀察時(shí)間增加未發(fā)生變化(P均>0.05)。在2、18、24、48、72 h，7組整體比較都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)。不同濃度A.lentulus比較，在2、18、24、48、72 h，A、B組比較，P>0.05，A、C組比較，B、C組比較，P均<0.05。不同菌株間比較，在2、18、24、48、72 h，C、D組比較，E、F比較，P均>0.05；C組分別與E、F組比較，P均<0.05。2、18、24、48、72 h時(shí)，A、B組與G組比較，P均>0.05。在2、18 h，C、D組與G組比較，P均>0.05。在24、48、72 h，C、D組與G組比較，P均<0.05。在2、18、24、48、72 h，E、F組與G組比較，P均<0.05。

表3 各組不同時(shí)點(diǎn)蠟螟幼蟲活動(dòng)度評(píng)分比較(分，

3 討論

蠟螟幼蟲模型最初應(yīng)用于細(xì)菌病原體中[9,10]，近年已擴(kuò)展到真菌，病毒等病原體中并取得了一定進(jìn)展[11]。蠟螟幼蟲作為小型哺乳動(dòng)物(如小鼠和大鼠)的替代宿主模型該模型，已運(yùn)用于宿主與病原體的相互作用的研究，不僅限于研究真菌感染的發(fā)病機(jī)理和抗真菌藥物的作用機(jī)理，也可用于宿主防御真菌病原體的研究[12～15]，病原體對(duì)藥物的敏感度、藥物毒力研究[16～18]。昆蟲免疫反應(yīng)在結(jié)構(gòu)和功能上與哺乳動(dòng)物先天免疫反應(yīng)具有相似性，尤其是蠟螟幼蟲血細(xì)胞和哺乳動(dòng)物中性粒細(xì)胞都具有吞噬并殺死病原體的作用[19]，并且在免疫應(yīng)答過程中可發(fā)生體表黑色素化更加有利于實(shí)驗(yàn)觀察?；谝陨舷灻鴦?dòng)物感染模型的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用蠟螟作為A.lentulus毒力的初步研究有一定的基礎(chǔ)支持及研究?jī)r(jià)值。

A.lentulus是Balajee等于2005年在4例造血干細(xì)胞移植患者分泌物中分離鑒定并作為煙曲霉菌的姊妹菌而成為新紀(jì)錄菌[1]。此后由于人們對(duì)A.lentulus認(rèn)識(shí)的不斷提高，日本[20]、巴西[21]、瑞士[22]、西班牙[23]、阿根廷[24]、土耳其[25]等一些國(guó)家醫(yī)學(xué)家已經(jīng)在接受心、肝、腎器官移植患者、慢性阻塞性肺氣腫患者、囊性纖維化等患者的支氣管肺泡灌洗液，痰液標(biāo)本中分離到A.lentulus，盡管A.lentulus是煙曲霉菌的姊妹菌，但是與煙曲霉菌相比具有獨(dú)特之處，如培養(yǎng)菌落呈現(xiàn)白色棉絮狀，產(chǎn)孢少，有小分生孢子頭，溫度超過48 ℃不能生長(zhǎng)，KOH直接鏡檢可見粗大有分隔分叉的透明菌絲。A.lentulus用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)分離培養(yǎng)基在37 ℃下培養(yǎng)2周，可見灰白色絨毛狀菌落，背面呈現(xiàn)灰白色或灰白色，鏡下可見分生孢子頭。煙曲霉菌及白色念珠菌作為臨床真菌學(xué)中最常見、研究最深入的真菌，而A.lentulus是煙曲霉菌的姊妹菌，以煙曲霉菌作為對(duì)照更能突出A.lentulus在煙曲霉菌菌屬中毒力的強(qiáng)弱。本研究顯示，蠟螟幼蟲生存指標(biāo)呈濃度依賴性，A組各項(xiàng)生存指標(biāo)較B、C組下降明顯。各組菌株感染的蠟蟲生存指標(biāo)隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng)而呈下降趨勢(shì)。同一時(shí)段不同菌株間生存指標(biāo)比較，A、B、C組生存率下降較D組慢，體表黑色素化及活動(dòng)度評(píng)分兩者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；A、B、C組各生存指標(biāo)較E、F組下降慢。

總之，A.lentulus患者菌株對(duì)蠟螟生存率、體表黑色素化、活動(dòng)度的影響均較白色念珠菌和煙曲霉菌弱，對(duì)蠟螟生存率的影響較A.lentulus標(biāo)準(zhǔn)菌株弱，對(duì)黑化作用及活動(dòng)度的影響與A.lentulus標(biāo)準(zhǔn)菌株相當(dāng)。