吳祥慶 楊姝麗 余燾

摘要 [目的]建立貝類產(chǎn)品中蝦夷扇貝毒素（YTX）的液相色譜-四極桿-靜電軌道場離子阱高分辨質(zhì)譜檢測方法。[方法]以牡蠣和文蛤?yàn)檠芯繉?duì)象，樣品經(jīng)甲醇提取，采用QuEChERS凈化，經(jīng)Hypersil GOLD C18色譜柱分離，乙腈和0.002 mol/L甲酸銨溶液（含0.2%甲酸）為流動(dòng)相梯度洗脫，負(fù)離子全掃描+數(shù)據(jù)依賴二級(jí)掃描，提取一級(jí)譜圖中準(zhǔn)分子離子精確質(zhì)量數(shù)定量，二級(jí)質(zhì)譜圖中特征離子精確質(zhì)量數(shù)定性。[結(jié)果]蝦夷扇貝毒素（YTX）在12 min內(nèi)出峰，定量限為0.3 μg/kg，在9.05～181.00 μg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r=0.996 4，回收率96.3%～102.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于14.2%（n=6）。[結(jié)論]該研究為貝類毒素監(jiān)控提供了技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞 貝類毒素;蝦夷扇貝毒素;液相色譜-高分辨質(zhì)譜

Abstract [Objective]The research aimed to establish a method for the simultaneous determination of Yessotoxins （YTX） in shellfish by liquid chromatographyquadrupoleorbitrap mass spectrometry.[Method]Oyster and clam samples were extracted with methanol and purified with QuEChERS technology.The analytes were isolated by Hypersil GOLD C18 column and gradient eluted with acetonitrile-0.002 mol/L ammonium formate solution （0.1% formic acid）.YTX were determined by orbitrap mass spectrometry through negative ion scanning， full scan mode and data dependent scan mode.[Result]The retention time of YTX was all within 12 min.The limits of quantification （LOQ） was 0.3 μg/kg.The calibration curves showed good linearity within the concentration range of 9.05-181.00 μg/L，r=0.996 4;the average recovery rate was 96.3%-102.8% and the relative standard deviations （RSD） were less than 14.2% （n=6）.[Conclusion] The study provides technical support for the monitoring of shellfish toxins.

Key words Shelfish toxin;Yessotoxins（YTX）;Liquid chromatographyhigh resolution mass spectrometry

貝類具有非選擇性濾食的習(xí)性，在海域生長過程中極易受到有毒微藻的污染。蝦夷扇貝毒素是一類多環(huán)聚醚海洋微藻毒素，最基本的結(jié)構(gòu)為YTX，目前發(fā)現(xiàn)一百余種衍生物，但具體化學(xué)結(jié)構(gòu)仍未完全確定。蝦夷扇貝毒素由網(wǎng)狀原甲藻、多邊舌甲藻和具刺膝溝藻產(chǎn)生，可大量累積在雙殼貝類體內(nèi)，主要分布在消化腺、胰腺等組織中。食用受蝦夷扇貝毒素污染的貝類產(chǎn)品會(huì)對(duì)心臟、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等造成損害[1-3]。蝦夷扇貝毒素廣泛分布于全球海域，對(duì)貝類產(chǎn)品食用安全的威脅不容忽視，歐盟第853/2004號(hào)法規(guī)規(guī)定蝦夷扇貝毒素總安全限量值為1 mg/kg。

檢測貝類毒素常用方法為小鼠生物法，但小鼠法不能區(qū)分貝類毒素的具體組分，準(zhǔn)確性和靈敏度都較差，目前已逐漸被儀器檢測方法取代[4-5]。液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法是檢測貝類毒素常用方法[6-8]，但由于分辨率低，貝類產(chǎn)品的基質(zhì)復(fù)雜，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜具有分辨率和靈敏度高的特點(diǎn)，能夠獲得碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)，現(xiàn)在已成為研究的新熱點(diǎn)[9-10]。該研究采用液相色譜-四極桿-靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜對(duì)貝類中蝦夷扇貝毒素（YTX）進(jìn)行檢測，采用QuEChERS技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行凈化，提高了樣品分析效率，為貝類毒素監(jiān)控提供了技術(shù)支持，也為食品安全提供了可靠保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象。貝類產(chǎn)品為近江牡蠣、文蛤，采集自欽州七十二涇、大風(fēng)江貝類養(yǎng)殖區(qū)。用清水沖洗干凈貝類外殼，切斷閉殼肌，打開外殼，用純水沖洗泥沙等異物，取肌肉等可食用部分，作為試樣，瀝干后均質(zhì)。冷藏運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室-18 ℃保存，備用。

1.1.2 主要儀器。U3000液相色譜（美國賽默飛世爾公司）;Q Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（美國賽默飛世爾公司）;HM100均質(zhì)器（北京格瑞德曼公司）;Centrifuge 5804R離心機(jī)（德國艾本德公司）;旋渦混合器（美國talboys公司）;Synergy純水儀（美國密理博公司）。

1.1.3 主要試劑。標(biāo)準(zhǔn)品：YTX（8.4±0.4 μg/mL），購自加拿大海洋生物科學(xué)研究所;甲醇、乙腈（色譜純，美國賽默飛世爾公司）;甲酸（色譜純，美國Sigma公司）;試驗(yàn)用水由純水儀制備;C18、GCB、PSA、MgSO4基質(zhì)分散固相萃取填料（上海安譜公司）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件。Hypersil GOLD C18色譜柱（1.9 μm，2.1 mm×100 mm）。流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.002 mol/L甲酸銨溶液（含0.2%甲酸）。梯度洗脫：0～1 min，30%A;1～7 min，30% A～90% A;7～10 min，90% A;10.1～12.0 min，30% A。流速0.2 mL/min。進(jìn)樣體積5 μL。柱溫40 ℃。

1.2.2 質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI）;掃描方式：負(fù)離子，一級(jí)全掃描+數(shù)據(jù)依賴二級(jí)掃描（FullMS+ddms2）;噴霧電壓：3 200 V;鞘氣流量：275 kPa;輔助氣流量：69 kPa;離子傳輸管溫度：320 ℃;一級(jí)掃描分辨率：70 000 FWHM;二級(jí)掃描分辨率：17 500 FWHM，歸一化碰撞能量：20、40、60 eV。

1.2.3 樣品前處理。準(zhǔn)確稱取2.00 g（精確到0.01 g）樣品于50 mL離心管中，加入10 mL甲醇，渦旋混勻1 min，超聲提取5 min，8 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液，殘?jiān)儆?0 mL甲醇重復(fù)提取1次，離心后合并上清液，加入1 g硫酸鎂、150 mg C18，漩渦混合30 s，8 000 r/min離心5 min，取10 mL上清液于50 ℃下氮吹至近干，用80%甲醇定容至1 mL，漩渦混合30 s，過0.22 μm濾膜，待儀器分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇 根據(jù)歐盟2002/657/EC，質(zhì)譜確證動(dòng)物產(chǎn)品中的有機(jī)殘留物需要4個(gè)識(shí)別點(diǎn)。通過高分辨質(zhì)譜獲得的母離子和子離子識(shí)別點(diǎn)分別為2.0和2.5 IPs，因此只需要獲得1個(gè)母離子和1個(gè)子離子，就能滿足對(duì)目標(biāo)化合物的確證要求。

在該研究中，YTX采用負(fù)離子模式，選擇[M-H]-作為定量離子，精確質(zhì)量數(shù)理論值為1 141.471 72，實(shí)際測定值為1 141.472 29，偏差0.5×10-6，質(zhì)量準(zhǔn)確度滿足要求。當(dāng)定量離子強(qiáng)度達(dá)到8×104則觸發(fā)數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)掃描，YTX特征二級(jí)碎片離子為[M-SO3-H]-，精確質(zhì)量數(shù)為1 061.518 31，實(shí)際測定值為1 061.518 31，偏差3.2×10-6，二級(jí)質(zhì)譜圖見圖1。

提取一級(jí)全掃描的精確質(zhì)量數(shù)定量，二級(jí)碎片離子定性。在同樣測試條件下，樣品與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間相對(duì)偏差在±5%以內(nèi)，且檢測到母離子與二級(jí)碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)與理論值相對(duì)偏差小于5×10-6，判定為陽性樣品。

2.2 色譜條件的選擇 該研究選用C18色譜柱，用乙腈和0.002 mol/L甲酸銨溶液（含0.2%甲酸）進(jìn)行梯度洗脫，在“1.2.1”的色譜條件下，YTX在12 min內(nèi)出峰，分析時(shí)間短，峰形尖銳，靈敏度高（圖2）。

2.3 樣品提取、凈化條件的優(yōu)化

2.3.1 樣品提取條件的優(yōu)化。根據(jù)YTX的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及相關(guān)文獻(xiàn)資料[11-14]，通過比較提取前、后加標(biāo)的回收率，考察了用乙腈、甲醇、80%甲醇的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種提取劑的提取率均能達(dá)到90%以上。但乙腈提取液蛋白質(zhì)等雜質(zhì)較多，凈化效果較差;80%甲醇作為提取液在后續(xù)濃縮過程中不易吹干。因此，該研究采用甲醇作為提取劑。

2.3.2 樣品凈化條件的優(yōu)化。QuEChERS技術(shù)是一種將固相萃取吸附劑分散到樣品萃取液中吸附雜質(zhì)的凈化方法，廣泛應(yīng)用于藥物殘留檢測中[15-16]。為降低貝類樣品中大量色素、脂肪、蛋白質(zhì)的影響，該研究采用QuEChERS法對(duì)提取液進(jìn)行凈化處理。通過在基質(zhì)溶液中加標(biāo)，添加不同固相萃取吸附劑，考察回收率方式，比較了C18、GCB、PSA這3種常用凈化劑的效果。單獨(dú)使用C18固相萃取劑時(shí)，凈化效果一般;添加PSA會(huì)使YTX回收率下降，這可能是由于YTX結(jié)構(gòu)中含有2個(gè)磺?；?，PSA作為堿性吸附劑對(duì)YTX吸附較強(qiáng);加入GCB后色素凈化效果較好，但是回收率較低。綜合考慮凈化效果與回收率，最終確定了使用2 g樣品加入150 mg C18固相萃取劑和1 g MgSO4。

2.4 線性范圍和檢出限 為避免凈化不完全帶來的基質(zhì)效應(yīng)，采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。取空白基質(zhì)樣品，按“1.2.3”樣品處理方法制得基質(zhì)溶液，在基質(zhì)溶液中加入標(biāo)準(zhǔn)品配成濃度為9.05、18.10、45.30、90.50、181.00 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.2.1”色譜條件和“1.2.2”質(zhì)譜條件上機(jī)測定。以被測組分的峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在9.05～181.00 μg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r=0.996 4。按照母離子信噪比（S/N）=3和S/N=10確定檢出限（LOD）和定量限（LOQ），發(fā)現(xiàn)YTX檢出限為0.1 μg/kg，定量限為0.3 μg/kg。這表明該方法完全可以滿足貝類毒素日常檢測的需要。

2.5 準(zhǔn)確度、精密度 選擇未檢出貝類毒素的牡蠣、文蛤作為空白基質(zhì)樣品，分別添加3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平做6個(gè)平行樣，結(jié)果見表1。從表1可以看出，在3個(gè)添加水平下蝦夷扇貝毒素（YTX）的平均回收率不小于96.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不大于14.2%。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的回收率和重現(xiàn)性較好。

2.6 樣品分析 應(yīng)用所建立方法對(duì)56個(gè)貝類產(chǎn)品進(jìn)行檢測，均未檢出蝦夷扇貝毒素（YTX）。

3 結(jié)論

通過QuEChERS技術(shù)結(jié)合液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜，能夠有效凈化貝類樣品基質(zhì)中的各種雜質(zhì)，快速測定貝類產(chǎn)品中蝦夷扇貝毒素。該方法快速簡單、靈敏度高、?線性良好，回收率、精密度均能滿足貝類產(chǎn)品中蝦夷扇貝毒素限量要求。

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