楊美華,康冀川2,*,雷幫星2,韓 龍,何 歡

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550025; 2.貴州大學(xué)西南特色藥用生物資源開(kāi)發(fā)利用教育部工程研究中心,貴州貴陽(yáng) 550025)

水稻是主要的糧食作物之一,全球有半數(shù)的人口以大米為主食[1-3]。由病原菌Magnaportheoryzae引起的稻瘟病則威脅著水稻的產(chǎn)量和品質(zhì),它是水稻最嚴(yán)重的真菌性病害之一,且有著傳播速度快,流行性強(qiáng),危害嚴(yán)重的特點(diǎn)[4-6]。

目前稻瘟病的防治方法主要是依靠化學(xué)手段和培育抗病品種[7],化學(xué)防治雖見(jiàn)效快,但長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑會(huì)有一定殘留,不僅會(huì)危害人畜健康,同時(shí)也給環(huán)境安全帶來(lái)一定壓力[8],而利用抗病品種也難以達(dá)到控制稻瘟病的目的[9]。相比之下,生物農(nóng)藥針對(duì)性強(qiáng)、選擇范圍廣,為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展、保護(hù)生態(tài)環(huán)境及保障食品安全提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐[10]。因此,生物防治成為了研究者研究的焦點(diǎn)。生物防治是利用生物的種間關(guān)系,以某種生物去抑制另外一種生物的生長(zhǎng)繁殖的方法[11]。目前利用微生物源制劑防治植物病害有良好應(yīng)用前景,廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)的有真菌、細(xì)菌及放線菌[12-13]。其中利用芽孢桿菌防治植物病害的研究較多,芽孢桿菌不僅能產(chǎn)生芽孢以度過(guò)不良環(huán)境,且能產(chǎn)生多種抑制植物病原菌的抗菌物質(zhì),是重要的微生物資源[14]。目前用于稻瘟病防治的芽孢桿菌主要有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyquefaciens)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、多黏類(lèi)芽孢桿菌(Bacilluspolymyxa)等[15-16]。

本研究選取的紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌he14用來(lái)防治稻瘟病還未見(jiàn)報(bào)道,目前紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌應(yīng)用于生物防治的報(bào)道較少。本文通過(guò)對(duì)生防細(xì)菌進(jìn)行拮抗活性的評(píng)價(jià)及對(duì)其發(fā)酵液耐高溫、耐酸堿和抗紫外線等方面進(jìn)行研究,以期為豐富稻瘟病生防菌資源及開(kāi)發(fā)生防菌劑打下一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)D1、解淀粉芽孢桿菌hd213、解淀粉芽孢桿菌DEB-2、嗜麥芽寡養(yǎng)假單胞菌(S.maltophilia)he41、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)F2、枯草芽孢桿菌H3、缺陷假單胞菌(Brevundimonasbullata)hd13、紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌(L.fusiformis)he14和稻瘟病病原菌(M.oryzae) 貴州大學(xué)貴州省生化工程中心分離保藏;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB) 上海博微生物科技有限公司;氫氧化鈉、鹽酸 成都金山化學(xué)試劑有限公司。

SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;LDZM-60L-IH立式高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;ZQlY-180N振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司;SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;Eppendorf高速離心機(jī) Eppendorf公司;JA2003電子天平 上海天平儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 稻瘟病生防菌的篩選 采用平板對(duì)峙法測(cè)定供試生防菌對(duì)稻瘟病的抑制作用[17]。將活化培養(yǎng)的稻瘟病病原菌用直徑為9 mm的打孔器打孔接種于PDA培養(yǎng)基平板中央,然后在其兩側(cè)對(duì)稱(chēng)等距接種經(jīng)NA固體培養(yǎng)基28 ℃活化培養(yǎng)2 d的細(xì)菌,以只接種病原菌的平板為空白對(duì)照。在28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)10～12 d待空白對(duì)照長(zhǎng)滿平板,觀察抑菌作用,測(cè)定病原菌菌落直徑,計(jì)算抑菌率,每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.2 生防菌發(fā)酵液的制備 將在NA固體培養(yǎng)基上經(jīng)28 ℃培養(yǎng)2 d的細(xì)菌單菌落接入NB營(yíng)養(yǎng)肉湯中,28 ℃、120 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h即得發(fā)酵種子液,然后以2%的接種量接種于裝有100 mL NB營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基的250 mL的錐形瓶中,28 ℃、120 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)48 h,得發(fā)酵液。發(fā)酵液經(jīng)4 ℃、10000 r/min離心處理10 min,收集上清液,再用0.22 μm無(wú)菌過(guò)濾器除菌得無(wú)菌發(fā)酵濾液,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 發(fā)酵液對(duì)稻瘟病的抑制作用 采用生長(zhǎng)速率法[18],用1×105Pa滅菌30 min后的PDA培養(yǎng)基(冷卻至50 ℃)以體積比配制成分別含細(xì)菌發(fā)酵濾液0.5%、1%、2%、4%、8%、16%、32%、64%的不同濃度的培養(yǎng)基,搖勻后倒入直徑為90 mm的無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板,以不加發(fā)酵濾液的PDA培養(yǎng)基作陰性對(duì)照,每個(gè)處理重復(fù)3次。用直徑9 mm的打孔器取已培養(yǎng)12 d的稻瘟病病原菌并接種于平板中央,于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d,測(cè)量各處理的菌落直徑,計(jì)算相對(duì)抑菌率,計(jì)算方法同1.2.1。

1.2.4 生防菌遺傳穩(wěn)定的測(cè)定 將分離鑒定保存至今的細(xì)菌活化在NA平板上,在28 ℃恒溫培養(yǎng),待長(zhǎng)出菌落后,每24 h轉(zhuǎn)接一次,轉(zhuǎn)接30次,其中選擇第1、5、10、15、20、25、30次的細(xì)菌進(jìn)行測(cè)定活性,基于1.2.3的方法選取PDA培養(yǎng)基含細(xì)菌發(fā)酵液體積為32%的方法,測(cè)定拮抗細(xì)菌對(duì)稻瘟病的拮抗活性,處理方法與1.2.3相同,測(cè)量菌落直徑,計(jì)算抑菌率,方法同1.2.1。

1.2.5 發(fā)酵液的熱穩(wěn)定性 將分離鑒定保存至今的細(xì)菌在NA平板上活化,按照1.2.2的方法制備好細(xì)菌發(fā)酵液并用0.22 μm的無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾得無(wú)菌發(fā)酵濾液,將無(wú)菌發(fā)酵濾液分別置于40、60、80、100、121 ℃下處理30 min,冷卻至室溫后與PDA混合[19],其余操作方法同1.2.3。記錄結(jié)果,測(cè)量稻瘟病菌菌落直徑,計(jì)算抑菌率,方法同1.2.1。

1.2.6 發(fā)酵液的抗紫外線穩(wěn)定性 將分離鑒定保存至今的細(xì)菌在NA平板上活化,按照1.2.2的方法制備好細(xì)菌發(fā)酵液并用0.22 μm的無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾得無(wú)菌發(fā)酵濾液,將制備好的細(xì)菌發(fā)酵濾液放在超凈臺(tái)上,液面高度調(diào)整為0.5 cm,分別照射無(wú)菌發(fā)酵液15、30、60、180、360 min后取出,經(jīng)紫外線照射處理后的發(fā)酵液再經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾,以未經(jīng)紫外線處理的發(fā)酵液作為對(duì)照抑菌活性效果。其余操作方法同1.2.3。記錄結(jié)果,計(jì)算抑菌率,方法同1.2.1[20]。

1.2.7 發(fā)酵液的耐酸堿性 將分離鑒定保存至今的細(xì)菌在NA平板上活化,按照1.2.2的方法制備好細(xì)菌發(fā)酵液并用0.22 μm的無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾得無(wú)菌發(fā)酵濾液,用5 mol/L氫氧化鈉、36%的鹽酸將發(fā)酵濾液的pH分別調(diào)為3、5、7、9、11,然后在室溫下靜置30 min,再將pH調(diào)為7,為防止污染,將經(jīng)過(guò)處理的發(fā)酵濾液再經(jīng)0.22 μm的無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾,其余操作方法與1.2.3相同。觀察并記錄結(jié)果,計(jì)算抑菌率,方法同1.2.1[21]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差進(jìn)行組間比較,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病生防菌的篩選

通過(guò)平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn),可以直觀看到生防菌對(duì)稻瘟病菌的抑制效果,如圖1所示。從8株供試菌株中篩出對(duì)稻瘟病菌有一定拮抗作用的菌株5株,在這5種菌中有4種有良好拮抗效果,其對(duì)稻瘟病菌的抑制程度見(jiàn)表1。通過(guò)計(jì)算,菌株D1、he41、he14及H3對(duì)稻瘟病引起的生長(zhǎng)抑制均大于61%,F2次之,抑制率為59.30%,其余3株均無(wú)明顯抑制作用,原因主要是:生防細(xì)菌能產(chǎn)生抗菌物質(zhì),抑制病原菌生長(zhǎng),但各生防細(xì)菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)存在差異,因此抗菌效果也不同[22]。

表1 不同拮抗細(xì)菌對(duì)稻瘟病菌的抑菌作用Table 1 Antibacterial effects of differentantagonistic bacteria on Magnaporthe oryzae

圖1 平板上抗真菌活性測(cè)定Fig.1 Antifungal activity assays on Petri plates注:a:空白對(duì)照;b:解淀粉芽孢桿菌D1;c:嗜麥芽寡養(yǎng)假單胞菌he41;d:枯草芽孢桿菌H3;e:紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌he14;f:枯草芽孢桿菌F2;g:解淀粉芽孢桿菌DEB-2;h:缺陷假單胞菌hd13;i:解淀粉芽孢桿hd213。

2.2 生防菌發(fā)酵液對(duì)稻瘟病菌的抑制作用

表2結(jié)果表明,稻瘟病菌在含無(wú)菌發(fā)酵濾液的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)被不同程度抑制,其菌絲生長(zhǎng)抑制水平與無(wú)菌發(fā)酵濾液濃度呈正相關(guān);當(dāng)采用含0.5%發(fā)酵濾液的培養(yǎng)基培養(yǎng)稻瘟病菌時(shí),稻瘟病菌菌絲依然能被輕微抑制,抑制效果在13.19%～25.02%之間;當(dāng)發(fā)酵液所占的比例達(dá)到32%時(shí),菌株D1、he41、he14、H3的無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)稻瘟病菌的菌絲抑制率均達(dá)90%以上,抑菌效果明顯;當(dāng)發(fā)酵液所占的比例達(dá)到64%時(shí),D1、he14、H3、he41的無(wú)菌發(fā)酵濾液能讓稻瘟病菌的菌絲均不能生長(zhǎng),即抑制率達(dá)100%。這與蔡長(zhǎng)平等[23]報(bào)道的放線菌CZ113的無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)稻瘟病的抑制效果果相似。

2.3 生防菌轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后對(duì)稻瘟病菌菌絲的抑菌效果

菌株D1、H3、he41、he14繼代培養(yǎng)30次,其中第1、5、10、15、20、25、30次的抑菌活性變化情況如圖2所示,各次數(shù)之間的抑菌率沒(méi)有顯著差異,且所有的生防菌對(duì)稻瘟病菌菌絲的抑菌率都在86%～100%之間,表現(xiàn)了良好的遺傳穩(wěn)定性,因此菌株D1、he14、he41、H3不易發(fā)生遺傳變異,能夠穩(wěn)定遺傳。相關(guān)研究結(jié)果多有報(bào)道生防細(xì)菌在多次繼代培養(yǎng)后依然能保持其抑菌效果。如張聰穎等[24]篩選到的枯草芽孢桿菌HT-6經(jīng)連續(xù)傳代10次后,對(duì)致病疫霉的抑菌率保持在80%以上。鄒秋霞等[25]報(bào)道的枯草芽孢桿菌YN145繼代培養(yǎng)25代后,對(duì)稻瘟病菌的抑制率保持在80%以上。綜上所述本文獲得的菌株D1、he14、he41、H3對(duì)稻瘟病菌的抑制作用與轉(zhuǎn)接次數(shù)不呈相關(guān)性,有良好應(yīng)用前景。

2.4 生防菌發(fā)酵液的熱穩(wěn)定性

生防菌無(wú)菌發(fā)酵濾液經(jīng)不同溫度處理后的結(jié)果如圖3所示。圖4直觀地展示了菌株he14的無(wú)菌發(fā)酵濾液在不同溫度處理后對(duì)稻瘟病的抑制效果。菌株D1、he41、H3的無(wú)菌發(fā)酵濾液在上述的溫度下處理后對(duì)稻瘟病菌菌絲均無(wú)抑菌作用,表現(xiàn)了極差的熱穩(wěn)定性,說(shuō)明它們所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)在加熱的條件下容易變性失活。由圖3和圖4可知,而菌株he14的發(fā)酵液在40、60、80、100 ℃的溫度條件下處理后,對(duì)稻瘟病菌菌絲的抑菌率仍保持在90%以上,在121 ℃處理30 min后,抑菌率下降到82%,但也表現(xiàn)了良好的熱穩(wěn)定性;菌株he14所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)大概分為兩部分,即大部分為耐高溫,少部分為對(duì)溫度敏感,易變性失活。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,抗菌物質(zhì)經(jīng)100、120 ℃處理后保持其良好抗菌活性的生防細(xì)菌較少,如多粘類(lèi)芽孢桿菌F17的無(wú)菌發(fā)酵液經(jīng)高溫處理后散失抗菌活性,短小芽孢桿菌F1和枯草芽孢桿菌H1的無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)溫度有良好的耐受性,經(jīng)高溫處理有明顯抗菌作用[26]。解淀粉芽孢桿菌Y5-18發(fā)酵液中的活性物質(zhì)經(jīng)100 ℃處理30 min后的抑菌率為60%[27]。與這些菌株相比,菌株he14的抗菌活性物質(zhì)對(duì)溫度有更好的耐受力。

圖3 紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌he14菌株發(fā)酵濾液在不同溫度處理30 min后對(duì)稻瘟病菌生長(zhǎng)的拮抗作用Fig.3 Antagonistic effect of the fermentation supernatantfiltrate of Lysinibacillus fusiformis he14 under differenttemperatures for 30 min on mycelium growth of M.oryzae

圖4 不同溫度對(duì)紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌he14菌株發(fā)酵液抑制稻瘟病菌的影響Fig.4 Different temperature effect the fermentation supernatantfiltrate of Lysinibacillus fusiformis he14 inhibiting the growth ofM. oryzae temperatures for 30 min on mycelium growth of M. oryzae注:a:空白對(duì)照;b:40 ℃;c:60 ℃;d:80 ℃;e:100 ℃;f:121 ℃。

2.5 生防菌發(fā)酵液的抗紫外線穩(wěn)定性

四株拮抗菌的發(fā)酵濾液經(jīng)紫外線照射不同時(shí)間后的結(jié)果如圖5,結(jié)果表明,菌株D1、he41、H3、he14的發(fā)酵濾液經(jīng)紫外線照射15、30、60、180、360 min對(duì)稻瘟病菌菌絲的抑菌率仍保持在83%～95%之間,抑菌率與照射時(shí)間不呈相關(guān)性,表現(xiàn)良好的抗紫外線穩(wěn)定性;其中菌株D1的抑菌率都為95%,效果最好;菌株he14、H3、he41的抑菌率稍次于菌株D1,但抑菌率仍在83%以上。相關(guān)研究結(jié)果多有報(bào)道生防細(xì)菌的抗菌物質(zhì)經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間紫外照射仍能保持良好的抑菌效果,解淀粉芽孢桿菌CWJ2經(jīng)紫外線處理30 min后的抑菌效果略有上升[28]。變綠色粘球菌YR-35的無(wú)菌發(fā)酵液經(jīng)30 W的紫外燈處理后,對(duì)馬鈴薯晚疫病的抑菌率保持不變[29]。本文的研究結(jié)果與已報(bào)道的研究結(jié)果相似。

圖5 菌株D1、he41、H3、he14發(fā)酵濾液在紫外線下照射不同時(shí)間后對(duì)稻瘟病菌生長(zhǎng)的拮抗作用Fig.5 Antagonistic effect of fermentation filtrates ofstrains D1,he41,H3 and he14 on the growth ofM. oryzae after ultraviolet light irradiation for different time

2.6 生防菌發(fā)酵液的耐酸堿性

不同pH條件下菌株D1、he41、he14、H3的無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)稻瘟病菌的抑菌活性變化情況如圖6。結(jié)果顯示,在pH在3～11之間變化時(shí),菌株D1、H3、he41的無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)稻瘟病菌菌絲的抑菌率保持在90%以上,抑菌率無(wú)明顯變化;菌株he14的無(wú)菌發(fā)酵濾液在pH11.0的偏堿環(huán)境時(shí),抑菌活力下降到82.12%。相關(guān)研究結(jié)果顯示,在偏酸和偏堿環(huán)境下生防菌抗菌物質(zhì)的抗菌效果弱于中性環(huán)境[30]。菌株SR13-2、WL2、YQ5的發(fā)酵液在pH2.0～12.0內(nèi)保持穩(wěn)定,但在pH為2.0、12.0時(shí)對(duì)致病疫霉的抑菌率明顯低于中性環(huán)境[31-33]。與報(bào)道的菌株相比,此研究的菌株D1、he41、H3、he14更具優(yōu)勢(shì),pH在3～11內(nèi)保持穩(wěn)定,具有潛在的研究意義。

圖6 菌株D1、he41、H3、he14發(fā)酵濾液在不同pH處理30 min后對(duì)稻瘟病菌生長(zhǎng)的拮抗作用Fig.6 Antagonistic effect of the fermentation supernatantfiltrate of D1,he41,H3 and he14 under different pHfor 30 min on mycelium growth of M. oryzae

3 討論

近年來(lái),篩選出高抑菌效果的生防菌株抑制稻瘟病菌、防治稻瘟病已成為水稻病害防治中的研究熱點(diǎn)。Meng等[34]研制的枯草芽孢桿菌T249粉劑,對(duì)稻瘟病的田間防治效果為77.6%～78.5%。Saikia等[35]分離的側(cè)孢短芽胞桿菌BPM3的發(fā)酵濾液對(duì)稻瘟病的防治效果為30.0%～67.0%,可減少35.05%～56.5%的產(chǎn)量損失。Suryadi等[36]篩選的堅(jiān)強(qiáng)芽胞桿菌E65的發(fā)酵液對(duì)稻瘟病菌的抑菌率為73%～85%。沙月霞等[37]分離的解淀粉芽孢桿菌S170對(duì)稻瘟病的溫室防治效果達(dá)80.57%。

目前,對(duì)生防芽孢桿菌的研究已深入到了許多方面,芽孢桿菌能夠產(chǎn)生脂肽類(lèi)物質(zhì)和抗菌蛋白等,對(duì)多種植物病原菌具有高效抑制作用[38]。Arima等[39]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的表面活性素具有抗病毒、抗支原體和抗細(xì)菌活性。Cho等[40]發(fā)現(xiàn),枯草芽孢桿菌KS03的主要抗菌化合物是伊枯草菌素A2。高娃等[41]的研究表明,解淀粉芽孢桿菌TF28抗菌蛋白Tas A基因的表達(dá)產(chǎn)物可以高效抑制黃瓜灰霉病。Yoshid等[42]報(bào)道從解淀粉芽孢桿菌RC22分離的抗菌蛋白對(duì)桑樹(shù)病原菌有良好抑制作用。本研究中的紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌he14經(jīng)30次繼代培養(yǎng),其無(wú)菌發(fā)酵濾液可耐受121 ℃高溫(30 min)、紫外線照射6 h、pH3～11,抑菌率保持穩(wěn)定,本研究同時(shí)還選取了稻瘟病菌另外兩個(gè)生理小種也進(jìn)行了試驗(yàn),紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌he14對(duì)其抑菌率也均達(dá)82%以上,且紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌he14用來(lái)防治稻瘟病還未見(jiàn)報(bào)道,具備了良好的研究?jī)r(jià)值。

4 結(jié)論

本研究的菌株D1、he41、H3、he14能穩(wěn)定遺傳,其代謝產(chǎn)物對(duì)稻瘟病菌有良好的抑制效果,且其抗菌物質(zhì)有明顯的耐酸堿穩(wěn)定性、抗紫外線穩(wěn)定性,菌株he14的抗菌物質(zhì)具有明顯的熱穩(wěn)定性,121 ℃下處理30 min仍能保持82%的抑菌活性,與報(bào)道的相比更好。利用這些特性菌株he14可作為生防菌劑開(kāi)發(fā)的潛能。本研究將會(huì)進(jìn)一步菌株D1、he41、H3、he14對(duì)稻瘟病的生防效果、抗菌物質(zhì)結(jié)構(gòu)和抑菌機(jī)理,為其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用做好基礎(chǔ)。