朱 磊,張馨心,謝艷英,王 浩,夏秀芳

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

多肽的氨基酸殘基和鏈構(gòu)型在物理因素(如熱、射線、機(jī)械振蕩等)或生化因素(如酶制劑、化學(xué)試劑等)的誘導(dǎo)下發(fā)生改變,導(dǎo)致蛋白分子的空間結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)相應(yīng)變化,被稱為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾。其中,蛋白質(zhì)在蛋白酶作用下結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的酶法修飾,可能賦予蛋白質(zhì)更好的功能和營(yíng)養(yǎng)特性[1]。酶法修飾主要分為酶解修飾和聚合酶法修飾,而類蛋白反應(yīng)(Plastein reaction)屬于后者,是指在合適的條件下,蛋白酶誘導(dǎo)高濃度的蛋白水解物通過縮合、轉(zhuǎn)肽和物理聚集等作用,形成新蛋白(沉淀或凝膠狀物質(zhì))的反應(yīng),其中凝膠狀物質(zhì)被稱為類蛋白物(Plastein)。在Plastein反應(yīng)過程中,還可以在酶促脅迫的作用下,添加理想的外源性氨基酸使其合成到新蛋白質(zhì)中,以提高蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。此外,蛋白水解物中的疏水性氨基酸殘基可以在Plastein反應(yīng)中被包埋聚集,從而減少蛋白質(zhì)水解物的苦味[2]。

海洋生物蛋白資源作為一種新型蛋白質(zhì)資源,在活性肽開發(fā)方面具有廣闊的前景[3]。已有研究將Plastein反應(yīng)應(yīng)用在海洋源蛋白生產(chǎn)加工上。許多海洋生物包括羅非魚[4]、海地瓜[5]、沙蟄[6]等蛋白可以通過Plastein反應(yīng)修飾來進(jìn)行改善。目前,Plastein反應(yīng)在海洋源蛋白應(yīng)用方面鮮有綜述性報(bào)道。

本文綜述了Plastein反應(yīng)的過程和機(jī)制,并著重闡述了Plastein反應(yīng)在提高海洋源蛋白的活性肽生物活性、改善蛋白的功能性質(zhì)、減少酶解液的苦味等方面的應(yīng)用。

1 Plastein反應(yīng)

1.1 Plastein反應(yīng)過程

Plastein反應(yīng)基本過程可分為三個(gè)反應(yīng)階段:a.水解,原料蛋白經(jīng)酶水解成濃度較低的蛋白水解物,一般為3%～5%;b.濃縮,將第一階段的蛋白水解物濃縮成較高濃度30%～50%的蛋白濃縮物,該過程通常使用噴霧干燥、冷凍干燥或蒸發(fā)等物理方法;c.合成反應(yīng),調(diào)節(jié)一定的pH、溫度,蛋白濃縮物在酶的誘導(dǎo)下形成類蛋白產(chǎn)物,其合成反應(yīng)中也可加入外源氨基酸進(jìn)行反應(yīng)合成。合成反應(yīng)所用的酶可以與水解過程的酶相同或者不同,且Plastein反應(yīng)的條件不同,所得到的類蛋白產(chǎn)物也會(huì)不同。

1.2 Plastein反應(yīng)的作用機(jī)制

Plastein反應(yīng)過程十分復(fù)雜,到目前為止類蛋白形成機(jī)制尚未完全闡明,初步形成的三種解釋Plastein反應(yīng)的機(jī)理包括:縮合反應(yīng)、轉(zhuǎn)肽作用以及物理聚集。

1.2.1 縮合反應(yīng) 縮合反應(yīng)是指通過共價(jià)鍵,蛋白水解物中肽和/或氨基酸形成肽鍵,故該反應(yīng)涉及到化學(xué)變化。小肽和氨基酸在酶的催化下,α-羧基和α-氨基通過脫水發(fā)生縮合反應(yīng),伴隨著反應(yīng)體系中游離氨基酸含量的下降,生成了新的高分子量的蛋白質(zhì)或肽[7]。周春霞等[8]以羅非魚下腳料水解物為原料,在胃蛋白酶誘導(dǎo)作用下進(jìn)行Plastein反應(yīng),高效液相色譜和凝膠電泳分析表明類蛋白的合成是一個(gè)提高體系分子量的過程,小分子的多肽和氨基酸縮合形成大分子量的蛋白質(zhì);因此,縮合作用在Plastein反應(yīng)中起到一定的作用。通過核磁共振技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù),也能證明Plastein反應(yīng)中較小疏水肽在蛋白酶的作用下縮合形成肽鍵,產(chǎn)生類蛋白物寡肽[9]。有研究顯示,在底物濃度較高時(shí),Plastein反應(yīng)主要依賴于縮合反應(yīng),而在底物濃度較低時(shí),縮合作用明顯減弱。此外也有研究表明,阻斷Plastein反應(yīng)前底物肽的氨基和羧基末端,僅略微降低了Plastein反應(yīng)物產(chǎn)率[10],說明肽縮合是次要作用,可能存在其他的Plastein形成機(jī)制。

1.2.2 轉(zhuǎn)肽作用 轉(zhuǎn)肽作用過程中有肽鍵斷裂與形成,導(dǎo)致氨基酸殘基的重新排列,氨基酸殘基從一個(gè)肽序列轉(zhuǎn)移到另一個(gè)肽序列,可能導(dǎo)致一些肽中疏水性氨基酸殘基的積累,并隨后形成聚集肽。因此,轉(zhuǎn)肽作用也涉及到肽鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。如果Plastein反應(yīng)僅發(fā)生縮合反應(yīng),則反應(yīng)體系中游離氨基總數(shù)應(yīng)呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)。然而,1959年Horowitz等[11]研究發(fā)現(xiàn)在類蛋白物形成過程中,使用三種不同的方法測(cè)得的游離氨基含量變化不大,但合成反應(yīng)并未終止。這也從側(cè)面證明了除了縮合反應(yīng)之外,Plastein反應(yīng)還存在著其它機(jī)制。1972年,Hofsten等[12]研究得出結(jié)論:Plastein反應(yīng)是一種分子重排過程,其中轉(zhuǎn)肽和水解比縮合反應(yīng)起更重要的作用,Plastein反應(yīng)趨向于形成不溶性復(fù)合物。Lozano等[13]用胃蛋白酶酶解白蛋白得到的水解物為底物,再加入胰凝乳蛋白酶催化合成類蛋白,在產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)不同分子量的肽片段均有增加,故該反應(yīng)中起主導(dǎo)作用可能是轉(zhuǎn)肽機(jī)制。而將外源性氨基酸添加到Plastein反應(yīng)中,主要也是通過轉(zhuǎn)肽作用即通過將氨基?；鶜埢鶑墓w肽轉(zhuǎn)移到受體肽而形成類蛋白產(chǎn)物。

1.2.3 物理聚集作用 除了縮合反應(yīng)和轉(zhuǎn)肽作用,類蛋白的形成也可能與非共價(jià)鍵參與的物理聚集作用包括疏水相互作用、氫鍵等有關(guān),而且疏水相互作用在類蛋白形成中至關(guān)重要,酶解產(chǎn)物中的疏水性氨基酸在疏水相互作用下被包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部,疏水相互作用越強(qiáng)則越有利于Plastein反應(yīng)的進(jìn)行[14]。在Andrews等[10]通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和中子小角散射實(shí)驗(yàn),證明了酪蛋白水解物的Plastein反應(yīng)是一個(gè)可逆熵驅(qū)動(dòng)的物理聚合反應(yīng)。Eriksen等[15]也認(rèn)為熵驅(qū)動(dòng)的物理聚合在Plastein反應(yīng)中起主導(dǎo)作用,由疏水相互作用導(dǎo)致不溶性凝膠產(chǎn)物類蛋白形成。也有研究表明由堿性蛋白酶酶解乳清分離蛋白得到的酶解產(chǎn)物,主要也是通過疏水相互作用誘導(dǎo)底物形成凝膠狀物質(zhì)[16]。Jiang等[17]對(duì)海地瓜酶解液進(jìn)行Plastein反應(yīng),通過加入十二烷基硫酸鈉破壞底物分子的疏水相互作用,結(jié)果類蛋白產(chǎn)率降低,再次說明疏水相互作用對(duì)于Plastein反應(yīng)產(chǎn)物的形成起著至關(guān)重要的作用。此外,又通過加入尿素破壞反應(yīng)底物中的氫鍵,結(jié)果類蛋白物產(chǎn)量減少,表明氫鍵也在某種程度上影響類蛋白物的形成。

總之,Plastein反應(yīng)機(jī)制比較復(fù)雜,目前主要為縮合反應(yīng)、轉(zhuǎn)肽作用和物理聚集這三種機(jī)制,由于Plastein反應(yīng)的底物是蛋白水解物,故也有學(xué)者將酶解反應(yīng)歸為Plastein反應(yīng)機(jī)制中。而至于哪一種反應(yīng)機(jī)制在合成Plastein反應(yīng)中占主導(dǎo)作用則由參與反應(yīng)的底物[18]、溫度[19]、pH[10]、酶等條件決定。有研究表明Plastein反應(yīng)需要在多種反應(yīng)共同作用下生成類蛋白產(chǎn)物,Liu等[20]研究了堿性蛋白酶誘導(dǎo)乳清蛋白水解物進(jìn)行Plastein反應(yīng)的過程,表明該條件下的肽聚集遵循兩步機(jī)制,如圖1所示。

圖1 轉(zhuǎn)肽和疏水性誘導(dǎo)形成類蛋白示意圖[2]Fig.1 The schematic diagram of plasteinformation involving transpeptidation andhydrophobicity-induced peptide aggregation[2]

2 Plastein反應(yīng)修飾在海洋源蛋白中的應(yīng)用

海洋生物蛋白資源豐富,而其副產(chǎn)物加工利用也越來越引起廣泛的關(guān)注。海洋源蛋白是理想蛋白的原料來源,其制備的生物活性肽具有安全性高、無毒、無副作用等優(yōu)點(diǎn)。但也存在著一定的不足之處,如活性肽生物活性不強(qiáng)、蛋白功能性質(zhì)不理想、酶解液有明顯的苦味等。而Plastein反應(yīng)能夠提高活性肽的生物活性、改善蛋白質(zhì)的功能特性、去除水解物苦味等。若能將Plastein反應(yīng)修飾技術(shù)運(yùn)用到海洋源蛋白加工上,將會(huì)給海洋蛋白資源利用帶來新的前景。

2.1 Plastein反應(yīng)修飾提高海洋蛋白源活性肽的生物活性

制備海洋生物活性肽的主要方法是酶解法,是因?yàn)槊附鈼l件溫和、水解過程易控、安全性高且能定位水解產(chǎn)生特定的肽[21]。然而,酶解不能產(chǎn)生新的氨基酸序列,所得多肽序列來源于蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu),是原蛋白質(zhì)氨基酸序列中肽片段的一部分。因此,肽的活性受到原蛋白序列的限制。在Plastein反應(yīng)合成過程中,轉(zhuǎn)肽和縮合涉及到蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化,會(huì)導(dǎo)致肽序列改變,可能改變多肽的生物活性。因Plastein反應(yīng)修飾技術(shù)在改善蛋白肽生物活性方面具有潛在的價(jià)值[2],趙新淮課題組對(duì)乳鐵蛋白[22-23]、酪蛋白[24-26]和大豆蛋白[27-28]等水解物進(jìn)行了Plastein反應(yīng)修飾研究,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過Plastein反應(yīng)修飾后,蛋白肽在抗癌活性、抑菌性、抗氧化活性以及降血壓活性等方面得到提高。而且,酶解產(chǎn)物進(jìn)行Plastein反應(yīng)過程中,可以添加某些外源氨基酸合成到類蛋白中,在一定程度上改善修飾產(chǎn)物的活性。據(jù)此,其提出了Plastein反應(yīng)修飾改善蛋白質(zhì)水解物活性的反應(yīng)機(jī)制——肽分子結(jié)構(gòu)重組機(jī)制,如圖2所示。通過Plastein反應(yīng)修飾海洋源蛋白以提高ACE抑制肽的活性以及增強(qiáng)抗氧化肽的活性等研究已有報(bào)道。

圖2 類蛋白反應(yīng)修飾提高蛋白質(zhì)水解物ACE抑制活性和抗氧化活性的分子機(jī)制——肽分子結(jié)構(gòu)重組[29]Fig.2 Suggested molecular mechanism for plastein reaction to enhance the ACE inhibitory or antioxidantactivities of protein hydrolysates——Structural reconstruction of peptide molecules[29]

2.1.1 Plastein反應(yīng)在改善海洋源蛋白ACE抑制肽活性中的應(yīng)用 ACE作為一種含鋅肽酰二肽酶,是含一條肽鏈,受氯離子和鋅離子影響活性的糖蛋白[30]。ACE在人體當(dāng)中主要起到升高血壓的作用,一方面ACE可催化血管緊張素Ⅰ(十肽)水解成八肽的血管緊張素Ⅱ,使血管進(jìn)一步收縮,血壓升高;另一方面ACE也可催化水解緩激肽而使其失去降壓活性。而ACE抑制肽是一類能夠抑制ACE活性的多肽,在人體中起到降血壓作用[31]。ACE抑制肽的C-端氨基酸和N-端氨基酸都會(huì)對(duì)ACE活性造成影響。N-端氨基酸性質(zhì)不明顯,而C-端氨基酸的性質(zhì)較明顯,主要為疏水氨基酸,且C-端氨基酸對(duì)ACE抑制肽的活性影響最大[32]。有研究表明從海參性腺中提取并純化得到的ACE抑制肽(NAPHMR)通過氫鍵或π鍵與ACE活性中心S2′結(jié)合位點(diǎn)或Zn2+的結(jié)合位點(diǎn)相互作用,從而達(dá)到了抑制ACE的效果[33]。

已有多項(xiàng)研究報(bào)道利用Plastein反應(yīng)修飾的方法改變海洋蛋白源多肽的序列結(jié)構(gòu)以增強(qiáng)多肽的ACE抑制活性,為尋找降血壓藥物替代品提供了新的思路。Li等[5]使用海地瓜蛋白酶解物做為原料,以蛋白水解物中游離氨基酸減少量為指標(biāo),探究Plastein反應(yīng)修飾對(duì)相應(yīng)ACE抑制肽的活性影響,并且通過添加外源氨基酸Tyr、Pro、Trp、Phe和Leu進(jìn)行Plastein反應(yīng)修飾,發(fā)現(xiàn)添加Pro效果最佳,能顯著提高ACE抑制活性。體系中游離Pro含量在反應(yīng)后顯著降低,說明Pro有可能結(jié)合到肽鏈中,將Plastein反應(yīng)修飾物純化后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)以及ACE抑制肽數(shù)據(jù)庫分析,得出肽的N-端Pro可能影響ACE結(jié)合位點(diǎn),從而降低ACE的活性。Jiang等[17]在此基礎(chǔ)上對(duì)海地瓜酶解液的Plastein反應(yīng)修飾機(jī)理進(jìn)行了探究,認(rèn)為疏水作用和氫鍵對(duì)類蛋白的形成起到了關(guān)鍵作用,這也為Plastein反應(yīng)應(yīng)用于提高蛋白質(zhì)或肽的ACE抑制活性提供了理論依據(jù)。用Plastein反應(yīng)改性ACE抑制肽過程中,其酶解底物所用的酶可以與Plastein反應(yīng)合成中的酶不同,韓青等[34]用木瓜蛋白酶酶解牡蠣,得到的牡蠣酶解產(chǎn)物后,在中性蛋白酶誘導(dǎo)下發(fā)生Plastein反應(yīng),最佳反應(yīng)條件為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%、加酶量1.0%、反應(yīng)時(shí)間2.5 h、反應(yīng)溫度30 ℃、pH7.0,反應(yīng)體系的游離氨基酸含量下降,得到的類蛋白產(chǎn)物ACE抑制率比修飾前提高了19%。原料蛋白種類不同,用于Plastein反應(yīng)合成的酶也不同。車麗輝[6]以大連沙蜇為研究對(duì)象,通過添加堿性蛋白酶對(duì)沙蜇物酶解的產(chǎn)物進(jìn)行6 h的Plastein合成反應(yīng),其反應(yīng)體系中游離氨基酸含量下降,經(jīng)Plastein反應(yīng)修飾后的沙蜇肽體外ACE抑制率顯著提高。

2.1.2 Plastein反應(yīng)在改善海洋源蛋白抗氧化肽活性中的應(yīng)用 自由基是人體進(jìn)行新陳代謝時(shí)必不可少產(chǎn)生的一種氧化產(chǎn)物。一旦體內(nèi)自由基過多,則會(huì)損傷機(jī)體的組織細(xì)胞,從而促進(jìn)衰老或引起其他各種疾病。抗氧化肽是具有較強(qiáng)抑制、延緩脂質(zhì)氧化和免除自由基侵害的功能的肽類。根據(jù)所涉及的化學(xué)反應(yīng),抗氧化肽主要通過兩種主要機(jī)制發(fā)揮其活性:氫原子轉(zhuǎn)移和電子供給[35]。

許多研究結(jié)果表明,Plastein反應(yīng)能夠增加抗氧化肽的活性,而且添加的酶的種類與外源性氨基酸對(duì)其結(jié)果都有著一定的影響。高丹丹等[36]用中性蛋白酶酶解泥鰍蛋白,在此基礎(chǔ)之上用木瓜蛋白酶對(duì)得到的酶解產(chǎn)物抗氧化肽進(jìn)行Plastein反應(yīng)修飾,通過響應(yīng)面優(yōu)化篩選出在酶添加量為1782.49 U/g、底物濃度為40%、His添加量為0.5 mmol/g、pH9.0、溫度35 ℃、時(shí)間3 h的條件下,酶解產(chǎn)物反應(yīng)體系中游離氨酸含量下降,Plastein反應(yīng)修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率高達(dá)77.98%。王朋[37]的研究也表明,經(jīng)Plastein反應(yīng)修飾的蛋白具有較好的抗氧化性,在加入1%的胃蛋白酶(按底物重量計(jì))的條件下,金槍魚酶解液在60 ℃反應(yīng)24 h后,合成的類蛋白溶液的DPPH自由基清除率、羥自由基清除率以及鐵還原能力都明顯增強(qiáng)。而在Plastein反應(yīng)過程中添加的外源性氨基酸種類,對(duì)類蛋白修飾產(chǎn)物的抗氧化性有一定的影響。劉揚(yáng)[38]以低廉花甲螺波紋巴非蛤?yàn)樵蠈?duì)其酶解,得到的酶解液可以通過添加不同外源性氨基酸進(jìn)行Plastein反應(yīng)修飾,發(fā)現(xiàn)按重量比3∶7加入Cys和Lys,Plastein反應(yīng)產(chǎn)物的羥自由基和DPPH自由基清除率有了顯著的提高。有研究發(fā)現(xiàn)沙蜇蛋白酶解液在20 ℃、酶加量2.5 kU/g,底物濃度35%的條件下,使用堿性蛋白酶進(jìn)行Plastein反應(yīng)修飾后,其抗氧化活性明顯提高;在此基礎(chǔ)之上,添加兩種外源氨基酸即Pro和Arg酸對(duì)沙蜇酶解肽進(jìn)行Plastein反應(yīng)改性,Plastein反應(yīng)修飾物的DPPH的清除率和羥基自由基清除率都有提高[6]。

2.2 Plastein反應(yīng)改善海洋源蛋白的食品加工性能

蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物具有凝膠性、熱穩(wěn)定性、溶解性、抗凍結(jié)性和乳化性等性質(zhì),可以賦予它們作為食品成分的多種用途。在Plastein反應(yīng)過程中蛋白質(zhì)在酶促脅迫的作用下產(chǎn)生交聯(lián),從而增加了溶液的粘稠度,提高了產(chǎn)物的流變學(xué)性質(zhì),這在生產(chǎn)質(zhì)構(gòu)化食品中具有應(yīng)用價(jià)值。在一定pH范圍內(nèi),由Plastein反應(yīng)產(chǎn)生的粘稠溶液具有良好的穩(wěn)定性,可作為食品凝膠。有研究者利用Plastein反應(yīng)修飾海參蛋白水解物合成類蛋白物,通過差式掃描量熱法發(fā)現(xiàn)在Plastein反應(yīng)修飾后蛋白的熱穩(wěn)定性增強(qiáng),并且其熱變性溫度從120 ℃增加到134 ℃[17]。而Ono等[39]使用堿性蛋白酶催化魷魚內(nèi)臟蛋白水解物進(jìn)行Plastein反應(yīng)制備的類蛋白物,熱穩(wěn)定性提高的同時(shí),溶解性也得到了一定的提升。Kolakowski等[40]使用胰蛋白酶催化歐鳊魚的酶解物,合成的類蛋白物具有凝膠能力以及良好的抗凍性等特點(diǎn)。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物用作沙拉醬、涂抹醬、冰淇淋、咖啡增白劑和肉制品中的乳化劑,而Plastein反應(yīng)是一種蛋白酶催化過程,能夠改善蛋白水解產(chǎn)物的乳化能力[41]。Kim等[42]以沙丁魚為研究對(duì)象,在沙丁魚水解物中添加外源性氨基酸異亮氨酸,通過木瓜蛋白酶的催化下進(jìn)行Plastein反應(yīng),得到的類蛋白其乳化活性顯著提高。此外,在Plastein反應(yīng)中通過添加谷氨酸二乙酯,可以提高蛋白水解物的水分散能力和持水能力。

2.3 Plastein反應(yīng)減少海洋源蛋白酶解液的苦味

海洋生物蛋白質(zhì)水解成小分子多肽,而得到的酶解產(chǎn)物產(chǎn)生的苦味對(duì)加工食品風(fēng)味影響很大,會(huì)降低消費(fèi)者對(duì)食品的接受度。目前蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物脫苦的方法,包括外肽酶處理、美拉德反應(yīng)、Plastein反應(yīng)和包埋[43]。蛋白水解物肽會(huì)在Plastein反應(yīng)中通過物理聚合作用下發(fā)生聚集,在疏水性誘導(dǎo)下疏水性氨基酸富集在一起以構(gòu)建“疏水核”。疏水性殘基與味蕾上的味覺接收器在空間上存在一定距離,從而達(dá)到了脫苦的效果。Plastein反應(yīng)可以有效減少蛋白水解產(chǎn)物的苦味,且不會(huì)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和功能造成破壞。Sukarno等[44]研究發(fā)現(xiàn)虎蝦副產(chǎn)物水解物通過天然酶催化進(jìn)行Plastein反應(yīng),作為引起肽苦味的苯丙氨酸含量從蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的22.5%下降到14.9%,另外,在固定化酶催化進(jìn)行Plastein反應(yīng)后蛋白產(chǎn)物苯丙氨酸含量極低。周春霞等[8]以羅非魚副產(chǎn)物用堿性蛋白酶酶解,得到的酶解液為底物,在胃蛋白酶的作用下進(jìn)行Plastein反應(yīng)修飾后,得到的類蛋白產(chǎn)物與未修飾的酶解液相比,風(fēng)味得到了明顯改善,基本沒有苦味。Suh等[45]將鏈霉蛋白酶水解阿拉斯加鱈魚作為底物,再利用菠蘿蛋白酶催化進(jìn)行Plastein反應(yīng)合成,結(jié)果顯示Plastein合成反應(yīng)顯著降低了鏈霉蛋白酶水解產(chǎn)物的苦味。在底物濃度為30%、pH為6～9范圍內(nèi),魷魚肝胰腺內(nèi)臟蛋白水解物在堿性蛋白酶催化下進(jìn)行Plastein合成反應(yīng)修飾后苦味減少,而且不影響烏賊蛋白水解液原有的抗氧化能力[39]。此外,Zhao等[46]在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上運(yùn)用正交試驗(yàn)優(yōu)化確定不同的Plastein反應(yīng)條件對(duì)黃鰭金槍魚內(nèi)臟蛋白的苦味影響,確定最佳條件為pH5、底物濃度40%、溫度為42 ℃,黃鰭金槍魚內(nèi)臟蛋白的苦味值顯著降低,并且電子鼻系統(tǒng)測(cè)試發(fā)現(xiàn)Plastein反應(yīng)修飾也能在一定程度上去除腥味。因此,Plastein反應(yīng)可以用來去除蛋白質(zhì)水解物苦味。

2.4 Plastein反應(yīng)的其他作用

Plastein反應(yīng)還具有從漁業(yè)廢物中回收蛋白質(zhì)的潛力。Madzlan等[47]以對(duì)蝦加工廠廢水為原料,經(jīng)菠蘿蛋白酶水解24 h后,再經(jīng)Plastein反應(yīng)合成蛋白產(chǎn)品。以三氯乙酸為沉淀劑時(shí),木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶的類蛋白生成率分別為27.35%和26.77%;而以乙醇沉淀后,木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶的類蛋白率分別為47.46%和45.19%,說明用乙醇沉淀得到的類蛋白率更高。Raghunath等[48]對(duì)魚制品廢棄物的進(jìn)行Plastein反應(yīng),用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和糜蛋白酶分別在pH5.0、6～7和8.0下合成類蛋白,其中胃蛋白酶生產(chǎn)類蛋白效率最高,產(chǎn)率可達(dá)19.88%。Ooshiro等[49]將Plastein反應(yīng)應(yīng)用于沙丁魚的副產(chǎn)物中,對(duì)蛋白質(zhì)資源進(jìn)行回收,其廢棄蛋白回收率為28%,且類蛋白產(chǎn)物經(jīng)乙醇和正己烷處理烘干后,具有良好的蛋白質(zhì)消化率。在Plastein反應(yīng)中也可添加其他的氨基酸酯,從而改善類蛋白物的氨基酸組成成分,提高食物蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

3 總結(jié)與展望

Plastein反應(yīng)是蛋白質(zhì)修飾中一種重要的酶促反應(yīng),主要通過縮合反應(yīng)、轉(zhuǎn)肽作用和物理聚集作用對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造。Plastein反應(yīng)最早是應(yīng)用于提高食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和減少酶解液苦味方面,近年來,利用Plastein反應(yīng)修飾活性肽改善蛋白功能特性的研究興起。Plastein反應(yīng)過程中需要的溫度和能量比較低,所用試劑都是食品級(jí),因此要優(yōu)于其他蛋白質(zhì)化學(xué)改性方法。

海洋功能性多肽食品的發(fā)展,可以提高海洋來源蛋白質(zhì)產(chǎn)品的附加值,并帶動(dòng)新興功能保健品快速發(fā)展。Plastein反應(yīng)作為綠色酶法修飾技術(shù),可以應(yīng)用到海洋功能性多肽食品加工生產(chǎn)中,在功能性食品方面具有良好的應(yīng)用前景。然而,目前仍然需要對(duì)于Plastein反應(yīng)修飾機(jī)理等問題進(jìn)行深入研究和補(bǔ)充,以期為制備理想型生物活性肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。其次,Plastein反應(yīng)投入高,但產(chǎn)量低,限制了Plastein反應(yīng)的商業(yè)應(yīng)用。需要在工業(yè)規(guī)模上控制該過程,以降低類蛋白的商業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用成本。如了解蛋白酶在Plastein反應(yīng)形成過程中的特殊作用,設(shè)計(jì)更有效的蛋白酶(通過改造其結(jié)構(gòu)的特定功能區(qū)域),不僅可以提高Plastein反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本,也為固定化蛋白酶進(jìn)行蛋白質(zhì)水解和類蛋白產(chǎn)物工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。