王艮衛(wèi),劉 展,馬繼偉,周文科,牛光明,?？肆?婁金峰

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450014 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 河南衛(wèi)輝 453100

缺血性腦血管病的早期病理機制是內(nèi)皮細胞功能障礙[1]。非對稱性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA)是一種超強的內(nèi)源性一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)抑制劑，可引起多種腦血管疾病的內(nèi)皮功能障礙[2-3]。研究[4]表明，ADMA可增加內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)血管炎癥反應(yīng)，加速腦血管疾病的進程。因此，抑制ADMA誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷和氧化應(yīng)激可能是治療缺血性腦血管損傷的有效方法。已有研究[5]表明，普羅布考可顯著抑制促炎細胞因子，抑制自由基介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，提高內(nèi)皮舒張功能，從而抑制泡沫細胞和動脈粥樣硬化斑塊的形成。普羅布考可在體外亨廷頓病模型中調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激[6]，改善無癥狀腔隙性腦梗死患者的內(nèi)皮功能[7]。本研究觀察了普羅布考對ADMA誘導(dǎo)的人腦微血管內(nèi)皮細胞(human brain microvascular endothelial cell,HBMEC)損傷的保護作用，并且分析其在JNK/P38 MAPK信號傳導(dǎo)通路中的作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞和主要試劑HBMEC購自北京拜爾迪診斷技術(shù)有限公司；RPMI 1640、胎牛血清購自美國Gibco公司；JNK特異性抑制劑SP600125、P38 MAPK特異性抑制劑SB203580和普羅布考購自美國Calbiochem公司；ADMA、Caspase-3檢測試劑盒購自美國Sigma公司；增強的化學(xué)發(fā)光蛋白印跡檢測試劑購自美國Pierce公司；DMSO、MTT、抗P38、抗p-P38、抗JNK和抗p-JNK多克隆抗體購自英國Abcam公司；LDH、ROS測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；小鼠抗β-actin單克隆抗體購自上海艾比瑪特醫(yī)藥科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠/兔IgG購自美國Santa Cruz公司。

1.2細胞培養(yǎng)和處理將HBMEC培養(yǎng)在含有105U/L青霉素、100 g/L鏈霉素和體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37 ℃用體積分數(shù)5%CO2在潮濕的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d更換一次培養(yǎng)基。將生長活躍的第4～6代HBMEC用于實驗研究。細胞分組如下。①治療組：加入30 μmol/L ADMA及普羅布考，其中普羅布考分為10-8、10-7、10-6、10-5mol/L 4個劑量組。②ADMA組：僅加入30 μmol/L ADMA。③普羅布考組：僅加入10-5mol/L普羅布考。④對照組：不加藥物。治療組細胞處理方法：將細胞在無血清培養(yǎng)基中饑餓處理24 h后用30 μmol/L ADMA進行處理，在ADMA處理前20 min給予普羅布考。普羅布考、ADMA干預(yù)細胞時間為24 h[8-9]。以上分組用于測定細胞活性、LDH釋放量和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF);其他指標測定時采用析因設(shè)計分為對照組、ADMA組、ADMA+普羅布考組、普羅布考組，ADMA劑量為30 μmol/L，普羅布考劑量為10-5mol/L。實驗另設(shè)對照組、ADMA組、ADMA+普羅布考組、ADMA+SP600125組、ADMA+SB203580組、普羅布考組，ADMA+SP600125組和ADMA+SB203580組分別用SP600125(10 μmol/L)和SB203580(25 μmol/L)處理1 h，其他處理條件同上。

1.3細胞活性的MTT法檢測將各組細胞置于96孔板中并在常規(guī)條件下培養(yǎng)至其融合率達80%。然后棄去培養(yǎng)基，每孔加入含有MTT(5 g/L)的新鮮培養(yǎng)基150 μL后培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μL DMSO并輕搖10 min以溶解甲瓚。采用酶標儀測定490 nm處的吸光度(A)，細胞活性=加藥組A/對照組A×100%。實驗設(shè)置3個復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.4LDH釋放量的比色法測定各組細胞用體積分數(shù)0.2%TritonX-100裂解，4 ℃、10 000×g離心2 min，收集上清液，在37 ℃與丙酮酸(0.5 mmol/L，25 μL)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(2 mmol/L，60 μL)共培養(yǎng)15 min，加入NaOH(0.4 mol/L)完成反應(yīng)。檢測530 nm處的A值，采用標準曲線法計算LDH釋放量。實驗設(shè)置3個復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.5細胞中丙二醛(MDA)和BDNF的ELISA法測定取各組細胞，5 000×g離心后收集細胞，加入PBS制成細胞懸液后，采用ELISA法測定MDA、BDNF。實驗設(shè)置3個復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.6細胞中ROS釋放量的DCFH-DA法測定各組細胞用PBS洗滌3次后，加入DCFH-DA 10 μmol/L在37 ℃培養(yǎng)6 h。然后將細胞置于微量滴定板的孔中應(yīng)用熒光酶標儀檢測各孔熒光強度，檢測條件為激發(fā)波長480 nm、發(fā)射波長530 nm，ROS釋放量以平均熒光強度表示。實驗設(shè)置3個復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.7細胞中bax、bcl-2、內(nèi)皮型NOS(eNOS)mRNA表達的RT-PCR法測定各組細胞提取并純化總RNA，反轉(zhuǎn)錄。bax、bcl-2、eNOS引物序列見表1，β-actin作為內(nèi)參。PCR條件： 94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃聚合30 s，35個循環(huán)。所得PCR產(chǎn)物在15 g/L瓊脂糖凝膠上進行分離，并在透照儀下用溴化乙錠顯色。目的mRNA相對表達量=目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。實驗重復(fù)9次。

表1 bax、bcl-2、eNOS及內(nèi)參引物序列

1.8細胞中Caspase-3蛋白活性的比色法測定收集各組細胞并用冷PBS洗滌，于裂解液中冰懸15 min。將裂解物以10 000×g離心20 min，收集上清液并計算蛋白濃度。取細胞提取物30 μg與200 μmol/L乙?；鵄sp-Glu-Val-Asp-p-硝基苯胺在37 ℃培養(yǎng)2 h后在405 nm處測定A。Caspase-3活性=加藥組A/對照組A。實驗設(shè)置3個復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.9細胞中p-JNK、JNK、p-P38、P38蛋白的免疫印跡法測定各組細胞在細胞裂解緩沖液中裂解，采用Bradford方法測定蛋白濃度。將20～30 μg蛋白加載到120 g/L SDS-PAGE凝膠上，并印跡到聚偏二氟乙烯膜上。將膜用25 g/L脫脂牛奶在37 ℃封閉1 h，加入一抗(JNK、p-JNK、P38、p-P38均按1∶1 000稀釋，內(nèi)參β-actin按1∶2 000稀釋)4 ℃培養(yǎng)過夜，加入二抗(均按1∶2 000稀釋)培養(yǎng)1 h后，采用化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶灰度值。目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。實驗重復(fù)9次。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析。不同組間HBMEC細胞活性、LDH釋放量、BDNF、p-JNK/JNK、p-P38/P38的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；MDA，ROS釋放量，bcl-2、bax、eNOS mRNA相對表達量，Caspase-3蛋白活性的比較均采用析因設(shè)計的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.17組細胞活性、LDH釋放量、BDNF的比較結(jié)果見表2。由表2可知，與對照組相比，ADMA組LDH釋放量升高，細胞活性和BDNF降低；與ADMA組相比，普羅布考組和各ADMA+普羅布考組LDH釋放量降低，細胞活性和BDNF升高。

表2 7組細胞活性、LDH釋放量、BDNF比較

*：與對照組相比，P<0.05；#：與ADMA組相比，P<0.05

2.24組細胞MDA,ROS釋放量,bcl-2、bax、eNOS mRNA相對表達量,Caspase-3蛋白活性的比較結(jié)果見表3。由表3可知，ADMA主效應(yīng)使MDA、ROS釋放量、bax mRNA相對表達量、Caspase-3蛋白活性升高，bcl-2、eNOS mRNA相對表達量降低；普羅布考主效應(yīng)使MDA、ROS釋放量、eNOS mRNA相對表達量升高，bcl-2、bax mRNA相對表達量及Caspase-3蛋白活性降低；且ADMA與普羅布考存在交互作用。

表3 4組細胞MDA,ROS釋放量,bcl-2、bax、eNOS mRNA相對表達量,Caspase-3蛋白活性的比較

2.36組細胞p-JNK/JNK、p-P38/P38的比較結(jié)果見表4。由表4可知，與對照組相比，ADMA組、ADMA+普羅布考組、ADMA+SP600125組、ADMA+SB203580組p-JNK/JNK、p-P38/P38升高；與ADMA組相比，ADMA+普羅布考組p-JNK/JNK、p-P38/P38降低。

表4 6組細胞p-JNK/JNK、p-P38/P38的比較

*：與對照組相比，P<0.05；#：與ADMA組相比，P<0.05

3 討論

有證據(jù)[10]表明，某些心血管疾病的內(nèi)皮功能障礙與血漿ADMA水平升高有關(guān)。因此，保護內(nèi)皮細胞免受ADMA誘導(dǎo)的損傷可能是缺血性腦血管疾病的有效治療方法。最近的研究[11-12]表明，普羅布考可以在體內(nèi)預(yù)防次氯酸鹽誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙，并在AD小鼠模型中預(yù)防血腦屏障功能障礙。

LDH是活細胞漿內(nèi)酶，細胞膜通透性變化時，細胞會將LDH釋放到培養(yǎng)液中，LDH釋放增加。BDNF能抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡，BDNF降低提示細胞抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡的能力下降，細胞更容易受損。在本研究中，用30 μmol/L ADMA處理HBMEC后，細胞LDH釋放增加，細胞活性和BDNF降低，這與之前的研究[5]結(jié)果相符。

近年來ROS被認為是細胞內(nèi)信號分子，且在細胞凋亡中起重要作用。已有報道[13]指出，ADMA通過內(nèi)皮細胞中“NOS活性的解偶聯(lián)”增加細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。該研究結(jié)果顯示， ADMA可顯著增加細胞內(nèi)ROS生成，并且下調(diào)HBMEC中eNOS的表達。作者還發(fā)現(xiàn)普羅布考預(yù)處理顯著降低了ROS的產(chǎn)生，增強了eNOS mRNA的表達。MDA是脂質(zhì)過氧化的一個重要指標。結(jié)果顯示ADMA顯著提高了體外培養(yǎng)的HBMEC中MDA的水平；而普羅布考顯著降低了由ADMA誘導(dǎo)的MDA形成。提示普羅布考通過抗氧化或調(diào)節(jié)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)保護內(nèi)皮細胞免受ADMA誘導(dǎo)的細胞毒性。

Bax/Bcl-2家族由許多重要的凋亡調(diào)節(jié)因子組成，Bax/Bcl-2表達的改變可影響細胞凋亡過程。Caspase-3主要處于細胞凋亡反應(yīng)的下游，是蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)的核心組成部分，在細胞凋亡過程中起著關(guān)鍵作用[14]。該研究結(jié)果顯示，經(jīng)ADMA處理后HBMEC中Caspase-3蛋白活性和bax mRNA表達上調(diào)，bcl-2 mRNA表達下調(diào)。普羅布考預(yù)處理可抑制bax mRNA的表達和Caspase-3蛋白活性，提高bcl-2 mRNA的表達，從而證實了普羅布考對ADMA誘導(dǎo)的細胞凋亡的保護作用。

據(jù)報道[14]，P38 MAPK的激活可誘導(dǎo)多種細胞凋亡。先前的研究[10]顯示，ADMA通過P38 MAPK/Caspase-3依賴信號通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡。此外，據(jù)報道[15]JNK磷酸化在細胞凋亡中起重要作用。作者應(yīng)用JNK特異性抑制劑SP600125和P38 MAPK特異性抑制劑SB203580處理細胞，結(jié)果顯示，ADMA可誘導(dǎo)JNK和P38 MAPK的磷酸化，而普羅布考預(yù)處理可抑制JNK和P38 MAPK信號的激活，正如用JNK和P38 MAPK特異性抑制劑處理的一樣。以上結(jié)果說明，普羅布考可以調(diào)節(jié)ADMA處理的HBMEC中JNK/P38 MAPK信號通路，這可能是普羅布考誘導(dǎo)的保護作用的潛在機制。之前的研究[5]顯示，與對照組相比，普羅布考對內(nèi)皮細胞不產(chǎn)生明顯的影響。本研究中析因分析結(jié)果顯示普羅布考主效應(yīng)對HBMEC各指標均產(chǎn)生影響，與上述研究[5]結(jié)果不符，需進一步研究證實。

總之，該研究結(jié)果證實了普羅布考對ADMA誘導(dǎo)的HBMEC損傷有保護作用，其作用機制為促進細胞活性、增加BDNF釋放、清除ROS、減少脂質(zhì)氧化和抑制細胞凋亡。此外，普羅布考可能是通過調(diào)節(jié)JNK/P38 MAPK信號通路發(fā)揮其保護作用。