孔永奎，孔存權(quán)，宋 婕，邵 明，王 莉，劉 欣，楊乾坤，呂先萍

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院輸血科 鄭州 450052 2)河南省人民醫(yī)院輸血科 鄭州 450003

因受到抗原、抗體減弱等的干擾，ABO血型血清學(xué)試驗(yàn)常常會(huì)遇到鑒定困難、表型異常等現(xiàn)象，這些異?，F(xiàn)象可由遺傳性或繼發(fā)性因素所致。遺傳性ABO表型變異稱為ABO亞型，其遺傳屬性決定了血型鑒定和交叉配血的困難性，在很大程度上影響了救治。若ABO亞型鑒定錯(cuò)誤，將大大增加輸血風(fēng)險(xiǎn)。目前“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”和“精準(zhǔn)輸血”理念方興未艾，分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)在輸血醫(yī)學(xué)的應(yīng)用進(jìn)一步推動(dòng)了“精準(zhǔn)輸血”的發(fā)展。ABO基因克隆和測(cè)序的完成使得進(jìn)一步闡明ABO亞型的分子遺傳學(xué)機(jī)制成為可能?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)ABO變異型等位基因300多個(gè)，其中B(A)亞型等位基因有6個(gè)[1]。因比較罕見(jiàn)且缺少群體遺傳學(xué)的統(tǒng)計(jì)，目前B(A)各型等位基因在人群中的分布不甚明了。國(guó)內(nèi)有些研究[2-5]認(rèn)為B(A)亞型中較常見(jiàn)的等位基因是BA.04和BA.02，這兩型通常被認(rèn)為是遺傳學(xué)B型，血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果多表現(xiàn)為AB型，但具體到個(gè)體，血清學(xué)可能會(huì)表現(xiàn)出較大的差異。本文擬通過(guò)一例B(A)02亞型的鑒定，來(lái)探討B(tài)(A)血型的分子遺傳學(xué)特征。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象患者(即先證者)女，28歲，孕12周，因在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院孕檢無(wú)法確定血型至鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院輸血科進(jìn)行血型鑒定。隨后采集其父母血樣進(jìn)行血型檢測(cè)。

1.2血清學(xué)鑒定主要試劑包括單克隆抗A、抗B(長(zhǎng)春博迅公司)，抗A1、抗H(Sanquin公司)，抗D IgM(珠海BASO)，抗A,B(上海血液生物醫(yī)藥公司)；人源抗A、抗B 為本實(shí)驗(yàn)室自制，效價(jià)128；Ac、Bc、Oc細(xì)胞購(gòu)自長(zhǎng)春博德公司。血型血清學(xué)鑒定和操作步驟參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》。

1.3ABO基因的擴(kuò)增和測(cè)序采用北京TIANGEN公司的血液基因組試劑盒抽提血樣DNA。參照文獻(xiàn)[6]建立的方法擴(kuò)增ABO基因的1～7外顯子，擴(kuò)增結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物上樣到含有GelRed的20 g/L瓊脂糖凝膠中，150 V電泳30 min，紫外透射儀下觀察擴(kuò)增是否成功。經(jīng)酶切純化后的PCR產(chǎn)物直接作為測(cè)序模板，嚴(yán)格按照BigDye試劑盒(ABI公司)說(shuō)明書操作，用ABI 3730測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.4單倍型分析將PCR產(chǎn)物割膠純化，用DNA連接酶將第7外顯子PCR產(chǎn)物連接到TA克隆質(zhì)粒pMD18-T中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，搖菌擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒DNA，測(cè)序后進(jìn)行單倍型分析。

1.5序列的分析和比對(duì)采用DNAMAN和Chromas Pro軟件進(jìn)行序列的拼接和比對(duì)。ABO等位基因的命名方法參照ISBT血型抗原等位基因數(shù)據(jù)庫(kù)。

2 結(jié)果

2.1血清學(xué)試驗(yàn)先證者及其父母ABO正反定型結(jié)果見(jiàn)表1，可以看出先證者與其父存在正反不符，結(jié)合血清學(xué)試驗(yàn)，認(rèn)為其表型符合AwB或B(A)亞型。

2.2ABO基因測(cè)序?qū)ο茸C者ABO基因1～7外顯子及其側(cè)翼序列進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示存在c.297A>G、c.526C>G、c.657C>T、c.700C>G(圖1)、c.703G>A、c.796C>A、c.803G>C、c.930G>A雜合突變及c.261delG。參照dbRBC等位基因數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)與A1.01和B.01參考序列比對(duì)(表2)，結(jié)合單倍型分析確定其基因型為ABO*BA.02/O.01.01，其中的單倍型基因BA.02與B.01相比，多了一個(gè)c.700C>G突變，說(shuō)明BA.02的遺傳背景來(lái)自于B.01基因。

表1 ABO正反定型鑒定結(jié)果

w+：微弱凝集；0：表示不凝集

圖1 BA.02第7外顯子c.700C>G雜合突變

位點(diǎn)297526657700703796803930ABO*A1.01ACCCGCGGABO*B.01GGTCAACAABO*BA.02GGTGAACA

2.3家系分析先證者為家中獨(dú)女，祖父母已逝，未采集到先證者兄弟姐妹的血樣。測(cè)序結(jié)果顯示，其父基因型為ABO*BA.02/O.01.02，其母為ABO*A1.02/O.01.01，先證者血型基因BA.02遺傳自其父(圖2)。

圖2 家系圖

3 討論

輸血前準(zhǔn)確鑒定患者血型很重要。ABO亞型常會(huì)導(dǎo)致血清學(xué)正反定型不一致，給患者輸血帶來(lái)很大的風(fēng)險(xiǎn)。分子生物學(xué)和遺傳學(xué)方法為解決疑難血型鑒定提供了強(qiáng)有力的工具。在遇到因血型亞型、異體輸血、父權(quán)確認(rèn)、嵌合體、自身免疫性溶血性貧血等引起的血清學(xué)鑒定困難時(shí)，可以通過(guò)基因測(cè)序和家系調(diào)查的方法來(lái)分析判斷[6-7]，結(jié)合基因型和表型結(jié)果來(lái)解釋疑難血清學(xué)現(xiàn)象。

常見(jiàn)ABO亞型主要有A3/B3、Ax/Bx、Am/Bm、Ael/Bel等，此外還有一大類Aw/Bw亞型，目前沒(méi)有進(jìn)行更詳細(xì)的分類。有研究者[8]提出對(duì)于現(xiàn)存4種表型歸類困難、出現(xiàn)弱凝集的反應(yīng)都可以鑒定為Aw亞型，但具體的基因型必須結(jié)合分子生物學(xué)試驗(yàn)才能最終確定。隨著單克隆抗A的應(yīng)用，B(A)亞型檢出率逐漸增高，主要是因?yàn)橛行S家的標(biāo)準(zhǔn)血清含有鼠源單克隆MHO4，其作為一種高效價(jià)的單克隆抗A試劑能夠凝集弱A抗原[2,9]。典型的B(A)亞型主要特點(diǎn)是“B強(qiáng)A弱”，紅細(xì)胞表面含有幾乎正常的B抗原和較弱的A抗原，血清中常含有幾乎正常的抗A；倘若是BA基因和A基因共同遺傳，B(A)表型則可能由于A抗原的掩蓋被判為正常AB型，因此其血清學(xué)存在很大的異質(zhì)性，僅憑血清學(xué)試驗(yàn)無(wú)法準(zhǔn)確判定其基因型。

本例B(A)亞型先證者為一名孕婦，血清學(xué)提示其為AwB或B(A)亞型，測(cè)序進(jìn)一步明確了其基因型為ABO*BA.02/O.01.01，家系分析證明其BA.02基因來(lái)自于父親遺傳而非自然突變。劉長(zhǎng)利等[4]研究認(rèn)為，B(A) 血型在我國(guó)獻(xiàn)血人群中的檢出率可能是1/(5～10)萬(wàn)，遠(yuǎn)高于歐洲人種的1/(17～58)萬(wàn)，推測(cè)BA.04和BA.02等位基因可能是我國(guó)北方漢族人群B(A)血型中的主要遺傳類型。金沙等[5]通過(guò)篩查大批量上海獻(xiàn)血者的cisAB和B(A)血型，發(fā)現(xiàn)B(A)血型BA.04和BA.02等位基因頻率較高，分別為1.6/10萬(wàn)和0.78/10萬(wàn)，與劉長(zhǎng)利等的推測(cè)基本一致，提示南方江浙一帶漢族人群B(A)血型的等位基因分布與北方相似。目前國(guó)際上已報(bào)道的BA等位基因有6個(gè)，遺傳背景都來(lái)自于B基因。近年來(lái)雖然國(guó)內(nèi)對(duì)B(A)的關(guān)注逐漸增多[10-13]，但其抗原形成的確切機(jī)制還未完全闡明。普遍認(rèn)為BA基因產(chǎn)物是一種典型的雙功能酶，既能夠加成大量的UDP-Gal(尿苷二磷酸-半乳糖，B抗原糖供體)，又能夠加成少量的UDP-GalNAc(尿苷二磷酸-N-乙酰半乳糖胺，A抗原糖供體)到H抗原上，從而使得B(A)紅細(xì)胞表面既含有B抗原又含有少量A抗原。具體到本例，其較B.01多了一個(gè)c.700C>G突變，從而導(dǎo)致第234位氨基酸由Pro突變?yōu)锳la。該突變?cè)谛蛄泻涂臻g上靠近4個(gè)關(guān)鍵氨基酸(第176、235、266、268位的氨基酸)，此4個(gè)氨基酸是GTA和GTB的區(qū)別所在。邱麗等[14]通過(guò)同源建模認(rèn)為p.Pro234Ala置換影響了第234位氨基酸與Met266分子間的作用力，改變了GTB識(shí)別供糖體結(jié)合凹槽的結(jié)構(gòu)，使GTB具有部分GTA活性，從而使B(A)血型糖基轉(zhuǎn)移酶具有了雙功能酶的活性，能夠結(jié)合并轉(zhuǎn)移少量UDP-GalNAc至底物H抗原上，導(dǎo)致紅細(xì)胞膜上形成弱A抗原，從而改變了ABO血型的抗原性。

因?yàn)锳BO亞型分子機(jī)制存在異質(zhì)性，即相同的表型可以出現(xiàn)不一樣的基因型，同一表型可能存在不同的分子遺傳機(jī)制[15]，因此臨床實(shí)踐中，我們不能僅從血清學(xué)表型來(lái)直接判斷基因型，反之亦然。鑒于本例B(A)02患者體內(nèi)沒(méi)有抗B抗體，且又在孕期，如果條件允許，可以采集自體血備用；若身體條件不允許，建議患者生產(chǎn)時(shí)備輸血可以選用洗滌B型或O型紅細(xì)胞，血漿、冷沉淀和血小板可以選用AB型。