徐 砜 鄭權(quán)友 李桂清 陳 戩 許桂蓮 (陸軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,重慶 400038)

銀屑病是一類慢性反復(fù)發(fā)作的皮膚炎癥性疾病，大多在40歲以下發(fā)病，其流行性分布隨著地理區(qū)域的分布及人種類別的差異而有所不同[1]。在銀屑病的發(fā)病機制中，目前認(rèn)為是免疫細胞與上皮細胞相互作用的結(jié)果[2]。其中，最為重要的是IL-23/IL-17通路產(chǎn)生的IL-17，IL-17作用于角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生銀屑病相關(guān)分子從而導(dǎo)致該病的發(fā)生發(fā)展[3,4]。多種類型的免疫細胞可分泌IL-17，且最近研究發(fā)現(xiàn)，分泌IL-17γδT細胞亞群與Th17亞群有近乎相同作用，在銀屑病中它們也被統(tǒng)稱為“T17”[5,6]。因此，分泌IL-17的γδT細胞的頻率也可作為銀屑病疾病程度的監(jiān)測指標(biāo)之一[7,8]。

Greb等[1]報道了在世界上不同地區(qū)人群中銀屑病的發(fā)病率存在差異，即銀屑病的發(fā)生與遺傳因素相關(guān)。人類皮膚和小鼠皮膚在結(jié)構(gòu)上非常相似，小鼠的皮膚下有環(huán)狀的毛囊、表皮更新較快，皮膚中有γδT淋巴細胞的存在，采用小鼠來模擬人的皮膚病模型已經(jīng)很成功地被應(yīng)用在銀屑病的研究當(dāng)中[9,10]。同時，實驗發(fā)現(xiàn)C5aR基因敲除后，咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣皮炎明顯減輕(SCI論著在投中)，但未比較不同遺傳背景下C5aR在銀屑病病理發(fā)生中的作用。本研究通過咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型，比較了C5aR+/+BALB/c、C5aR-/-BALB/c、C5aR+/+C57BL/6和C5aR-/-C57BL/6 4組小鼠病情的嚴(yán)重程度，探討了C5aR基因缺陷在不同遺傳背景下對咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病病情的影響。

1 材料與方法

1.1材料 雌性8～12周齡SPF(specific-pathogen-free)級C57BL/6以及BALB/c小鼠均購自北京華阜康生物科技有限公司；C5aR-/-BALB/C小鼠[C.129S4(B6)-C5ar1tm1Cge/J]購自JACKSON實驗室；C5aR-/-C57BL/6小鼠為本實驗室構(gòu)建(C5aR-/-BALB/c小鼠和C5aR+/+C57BL/6小鼠雜交，然后將所得雜合子C5aR+/-再與C5aR+/+C57BL/6小鼠回交連續(xù)12代以上，再將雜合子C5aR+/-自交，篩選出C5aR-/-子代，即C5aR-/-C57BL/6小鼠)。所有實驗小鼠均飼養(yǎng)于陸軍軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)研究所SPF級層流動物房，自由飲食飲水至合適周齡，備用。TRIzol試劑盒、遞轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司；Ⅳ型膠原酶、Ionomycin、Invitrogen購自Sigma公司；熒光標(biāo)記抗體購自Ebioscience公司；流式細胞儀購自BD FACS CantoⅡ公司。

1.2方法

1.2.1小鼠分組及銀屑病模型的建立 小鼠分為4組：C5aR+/+BALB/c (5只/組)、C5aR-/-BALB/c(4只/組)、C5aR+/+C57BL/6(5只/組)和C5aR-/-C57BL/6(4只/組)小鼠組。4組小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉后，剃刀刮除右側(cè)背部皮膚被毛，形成約3 cm×2 cm的裸露皮膚區(qū)域。剔除被毛24 h 后在小鼠背部皮膚裸露區(qū)涂抹等量 (60 mg/d) 的咪喹莫特乳膏 (四川明欣利迪藥業(yè)有限公司)，連續(xù)給藥5 d，最后一次給藥24 h后處死小鼠并取材。

1.2.2小鼠銀屑病樣皮損的評價 按照PASI標(biāo)準(zhǔn)，于每日給藥前觀察小鼠背部皮膚裸露區(qū)并評分，根據(jù)皮損處紅斑(erythema，E)、浸潤(infiltration，I)、鱗屑(scales，S)三項指標(biāo)由輕至重按照0～4分的標(biāo)準(zhǔn)進行評分并相加得到總分。繪制隨時間變化的評分曲線。

1.2.3小鼠皮損局部組織HE染色 小鼠斷頸處死后，于背部皮損局部隨機取2塊皮膚組織，經(jīng)4 %多聚甲醛固定后，行脫水、石蠟包埋、切片處理，按照HE染色的操作步驟進行染色。每個樣本隨機選取兩張切片進行HE染色，每張切片隨機選取3個視野進行拍照，對表皮棘層的增生層數(shù)進行分析。

1.2.4熒光定量PCR 利用TRIzol試劑盒提取小鼠誘導(dǎo)銀屑病后皮損組織中的總RNA，以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA后，應(yīng)用熒光定量PCR試劑盒進行擴增，檢測小鼠誘導(dǎo)銀屑病后皮損組織中IL-17的表達。引物序列如下：β-actin上游引物：5′-ATGACCCAAGCCGAGAAGG-3′，下游引物：5′-CGGCCAAGTCTTAGAGTTGTTG-3′；IL-17上游引物：5′-TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA-3′，下游引物：5′-CTTTCCCTCCGCATTGACAC-3′。

1.2.5流式細胞儀檢測小鼠皮膚局部組織IL-17A+γδT細胞亞群的浸潤 小鼠斷頸處死后，取1 cm×1 cm 皮膚組織置于1.5 ml EP管中，充分剪碎至勻漿，加入2.5 mg/ml的Ⅳ型膠原酶后于37℃搖床消化1.5 h，過濾，1 800 r/min離心后以1 ml RPMI1640 培養(yǎng)基重懸細胞，加入PMA(10 ng/ml)和Ionomycin(250 ng/ml)和BFA(Invitrogen 1 000×)1 μl，于CO2孵箱培養(yǎng)4 h。收集細胞后，加入抗CD3、γδTCR和IL-17A的熒光標(biāo)記抗體，流式細胞儀檢測目的亞群百分比。細胞因子的刺激和胞內(nèi)阻滯以及染色的具體方法見文獻[11、12]。

1.2.6流式細胞儀檢測小鼠引流淋巴結(jié)中IL-17A+γδT細胞亞群的百分比 小鼠斷頸處死后，剪開腋下皮膚暴露皮下淋巴結(jié)，取出淋巴結(jié)后置于70 μm篩網(wǎng) (Falcon) 上輕柔研磨，并加入PBS緩沖液沖洗，離心后用RPMI1640 培養(yǎng)基重懸細胞,同上述方法加入PMA、Inomycin和BFA刺激胞內(nèi)因子的分泌并阻滯在胞內(nèi),流式細胞儀檢測目標(biāo)亞群的百分率。

2 結(jié)果

2.1與相應(yīng)BALB/c小鼠相比，C5aR+/+或C5aR-/-C57BL/6小鼠銀屑病樣皮炎表型減輕 圖1A顯示在使用咪喹莫特乳膏連續(xù)5 d涂抹于4組小鼠背部皮膚后，誘導(dǎo)出嚴(yán)重程度不同的銀屑病樣皮炎表型。在相同遺傳背景下，與C5aR+/+小鼠相比，C5aR-/-小鼠的皮損情況均有所減輕；在不同遺傳背景下，C5aR+/+和C5aR-/-C57BL/6小鼠較相應(yīng)BALB/c小鼠皮損情況減輕 (圖1A)。圖1B顯示依據(jù)PASI評分標(biāo)準(zhǔn)，在咪喹莫特給藥1 d后開始，根據(jù)4組小鼠背部皮膚紅斑、鱗屑、浸潤的嚴(yán)重程度進行評分后累加并記錄，繪制隨天數(shù)增加的評分曲線圖，比較4組小鼠皮損的總體差異。在相同遺傳背景下，C5aR-/-小鼠的PSAI評分均較C5aR+/+小鼠低(P<0.05)；不同遺傳背景條件下,C57BL/6背景的C5aR+/+和C5aR-/-小鼠較BALB/c背景的相應(yīng)小鼠PASI評分均顯著降低(圖1B，P<0.05)。與BALB/c小鼠相比，C57BL/6遺傳背景的C5aR+/+小鼠和C5aR-/-小鼠咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣皮炎顯著減輕。

2.2與相應(yīng)BALB/c小鼠相比，C5aR+/+或C5aR-/-C57BL/6小鼠銀屑病樣皮炎的表皮組織較薄、 表皮增生程度較輕 圖2A為BALB/c和C57BL/6小鼠皮膚組織的HE染色結(jié)果，圖2B為經(jīng)Image J軟件測量小鼠炎癥表皮厚度的結(jié)果。從4組小鼠皮膚組織的HE染色及皮膚表皮組織的半定量分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)：4組小鼠在咪喹莫特干預(yù)后，表皮棘層有不同程度的增厚。在不同遺傳背景下，與相應(yīng)BALB/c小鼠相比，C57BL/6背景的C5aR+/+小鼠與C5aR-/-小鼠表皮棘層增厚程度均較輕(圖2)。

圖1 不同遺傳背景(BALB/c 和 C57BL/6)小鼠對咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣皮炎敏感性的比較Fig.1 Comparison of IMQ-induced psoriasis skin infla-mmation in BALB/c and C57BL/6 backgro-und miceNote: A.The BALB/c strain mice and C57BL/6 strain mice back psoriasis-like skin inflammation induced by IMQ for 5 days；B.The PASI scores of four groups mice.C5aR+/+ mice，n=5;C5aR-/-mice，n=4，*.P<0.05.

圖2 銀屑病樣皮炎小鼠背部皮膚組織的HE染色Fig.2 HE staining of back skin lesion sections in mice with psoriatic-like skin inflammationNote: A.HE staining of psoriatic-like skin inflammation sections on day 5(×100)；B.The epidermis thickness of psoriasis-like skin mice,n=5;C5aR-/- mice,n=4，*.P<0.05.

圖3 銀屑病樣皮炎小鼠背部皮膚組織中IL-17A mRNA的表達水平Fig.3 mRNA levels of IL-17A in back skin lesion sections in mice with psoriasis-like skin inflammationNote: A.The IL-17 mRNA levels in back skin tissues were compared between C5aR+/+ and C5aR-/-mice with both BALB/c and C57BL/6 background；B.The IL-17 mRNA levels in back skin tissues were compared between BALB/c and C57BL/6 mice.C5aR+/+ mice,n=5;C5aR-/-mice,n=4.The values were presented as 1.

圖4 流式細胞儀分析銀屑樣皮炎小鼠背部皮損局部和引流淋巴結(jié)中IL-17A+γδT細胞的百分率Fig.4 Percentage of IL-17A+γδT cells in back skin lesion tissues and draining lymphnodes in mice with psoriasis-like skin inflammation by FACSNote: A-C.Percentages of IL-17A+γδT cells in back skin lesions tissues of C5aR+/+ and C5aR-/- mice；D-F.Percentages of IL-17A+γδT cells in draining lymphnodes of C5aR+/+ and C5aR-/-mice.C5aR+/+ mice，n=5;C5aR-/-mice，n=4.The values were presented as

2.3與相應(yīng)BALB/c小鼠相比，C5aR+/+或C5aR-/-C57BL/6小鼠銀屑病樣皮損局部IL-17 mRNA水平減少 Teunissen等[3]報道銀屑病皮膚組織中IL-17 mRNA水平是反映疾病嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一。為了進一步驗證4組小鼠皮膚組織中IL-17 mRNA的表達情況，我們提取了4組小鼠誘導(dǎo)銀屑病后的皮膚組織的總RNA，通過qRT-PCR檢測皮膚局部的IL-17 mRNA的表達情況。如圖3A所示，在相同遺傳背景下，C5aR-/-小鼠皮膚局部的IL-17 mRNA的相對表達量均低于C5aR+/+小鼠(BALB/c小鼠：P<0.05；C57BL/6小鼠：P<0.05)。如圖3B所示，在不同遺傳背景下，與BALB/c小鼠相比，C57BL/6 小鼠皮膚組織中IL-17 mRNA的表達顯著減少(C5aR+/+小鼠：P<0.000 1； C5aR-/-小鼠：P<0.000 1)。

2.4與相應(yīng)BALB/c小鼠相比，C5aR+/+或C5aR-/-C57BL/6小鼠皮損局部組織和引流淋巴結(jié)中γδT細胞百分比顯著降低 將4組小鼠誘導(dǎo)銀屑病后的皮膚組織消化收集細胞懸液、染色、流式細胞儀檢測γδT細胞的百分率。結(jié)果如圖4A所示，在4組小鼠皮膚組織中的IL-17A+T淋巴細胞中，γδT細胞所占比例有所不同。在不同遺傳背景下(圖4B)，C57BL/6小鼠的IL-17A+γδT細胞百分率較BALB/c 小鼠顯著減少(C5aR+/+小鼠：39.68% 65.52%，P<0.05；C5aR-/-小鼠：24.55% 53.23%，P<0.05)；在相同遺傳背景下(圖4C)，C5aR-/-小鼠IL-17A+的γδT細胞百分率較同背景的C5aR+/+小鼠顯著減少(BALB/c 背景：53.23%、65.52%，P<0.05；C57BL/6背景：24.55%、39.68%,P<0.05)。同時，將4組小鼠誘導(dǎo)銀屑病后的右側(cè)腋窩淋巴結(jié)取樣，經(jīng)研磨、染色后流式細胞儀檢測，得到類似的結(jié)果(圖4D～F)，即4組小鼠的IL-17A+γδT細胞亞群百分率的變化與背部皮損組織浸潤的IL-17A+γδT細胞趨勢一致。

3 討論

銀屑病被認(rèn)為是一類與自身免疫系統(tǒng)失調(diào)相關(guān)的自身免疫性疾病。目前的研究認(rèn)為，分泌IL-17的γδT細胞為該病發(fā)揮效應(yīng)的主要細胞類型[13]。

Giacomassi等[14]揭示了補體系統(tǒng)在小鼠銀屑病模型中的重要作用。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，C5aR基因缺陷小鼠可顯著衰減咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣皮炎(未發(fā)表結(jié)果，投稿中)。雖然有報道較之于C57BL/6小鼠，BABL/c背景的小鼠更易產(chǎn)生炎癥較重而且鱗屑較多的皮炎表型，但并未對其進行分子或細胞學(xué)方面的對比[15]。本研究為進一步研究小鼠遺傳背景對該病動物模型的影響，比較了C5aR+/+BALB/c、C5aR-/-BALB/c、C5aR+/+C57BL/6和 C5aR-/-C57BL/6 4組小鼠對咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣皮炎的敏感性。結(jié)果觀察到，4組小鼠均成功誘導(dǎo)銀屑病樣皮炎，但不論是C5aR+/+或 C5aR-/-小鼠，C57BL/6背景的小鼠均比BALB/c背景小鼠表型較輕；皮炎組織的病理切片也提示上述同樣的結(jié)果。該結(jié)果進一步證實了Giacomassi等[14]的研究報道，補體系統(tǒng)的確在銀屑病的發(fā)病中起到十分重要的作用，且遺傳背景會影響小鼠對銀屑病炎癥反應(yīng)的敏感性。

Han等[16]研究證實C5aR在膿毒血癥中對γδT細胞具有調(diào)節(jié)性作用，我們的結(jié)果也顯示，在皮膚組織局部浸潤的淋巴細胞中，相同遺傳背景下，C5aR-/-小鼠均比C5aR+/+小鼠的皮膚組織局部IL-17A+γδT細胞的比例顯著降低。而且基因表型相同，遺傳背景不同的條件下，C57BL/6小鼠的皮膚組織局部γδT細胞比例均較低，同時相應(yīng)皮膚組織局部的IL-17mRNA相對表達量也較低。在C57BL/6小鼠中，γδT細胞的比例較少，從而導(dǎo)致IL-17分泌較少，對表皮角質(zhì)形成細胞的刺激較輕，因此炎癥程度較輕。

綜上所述，本研究結(jié)果表明：不同遺傳背景的小鼠對于咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣皮炎的敏感性不同，與相應(yīng)BALB/c小鼠相比，C5aR-/-和C5aR+/+C57BL/6小鼠敏感性均相對較低，且BALB/c背景的小鼠更容易也更適合建立銀屑病動物模型，這一研究為銀屑病動物模型的建立提供了指導(dǎo)意義。