郭淑芳 姜婷婷 (延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，延安 716000)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA) 是一種臨床常見的自身免疫性疾病，主要特征為關(guān)節(jié)慢性滑膜炎癥[1]。RA患者在發(fā)病后兩年內(nèi)即可出現(xiàn)不可逆的關(guān)節(jié)損害，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。單核/巨噬細(xì)胞是RA滑膜組織以及關(guān)節(jié)液中數(shù)量最多的免疫細(xì)胞，通過分泌活性因子、抗原提呈等調(diào)節(jié)免疫功能[3]。單核/巨噬細(xì)胞過度活化導(dǎo)致滑膜慢性炎癥，其還能分泌TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子，加劇炎癥反應(yīng)，促進(jìn)RA患者病情的惡化[4]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性的非編碼小分子單鏈RNA，長度為18～25個核苷酸，在炎癥反應(yīng)、固有免疫以及腫瘤發(fā)生和發(fā)展等生物學(xué)過程中起重要的調(diào)節(jié)作用[5-7]。研究顯示，miR-217在乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)miR-217表達(dá)可抑制乙醇誘導(dǎo)的肝臟炎癥[8]。miR-217在高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞(RMC)中表達(dá)上調(diào)，miR-217基因沉默可抑制高糖培養(yǎng)的大鼠RMC細(xì)胞炎癥反應(yīng)和纖維化[9]。目前，miR-217對RA患者PBMC細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響還未見報道。本研究分離培養(yǎng)RA患者外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，采用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)PBMC細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，探討miR-217對RA患者PBMC細(xì)胞炎癥反應(yīng)影響及其作用機制，為RA的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 人AB血清購自上海素爾生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Trizol試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；PCR試劑盒購自TaKaRa公司；引物序列由上海生物工程公司設(shè)計提供；RIPA蛋白裂解液和BCA蛋白測定試劑盒購自碧云天公司；轉(zhuǎn)染相關(guān)miR-217陰性對照、miR-217 mimics等均購自Ambion公司；沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(sirutuin1，Sirt1)抗體購自美國Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記的二抗購自武漢艾美捷科技有限公司。LipofectamineTM2000試劑盒購自上海陽光生物科技有限公司；熒光素酶檢測試劑盒購自漢恒生物工程(上海)有限公司。

1.2方法

1.2.1RA患者PBMC細(xì)胞的分離培養(yǎng) RA患者診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)2010年美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(EULAR)的RA分類標(biāo)準(zhǔn)[10]。參照文獻(xiàn)[11]方法分離培養(yǎng)RA患者PBMC細(xì)胞。采集RA患者外周靜脈血，應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液采用Ficoll密度梯度離心法分離PBMC，使用AB血清和DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 PBMC細(xì)胞接種于24孔板中，LPS預(yù)刺激24 h后PBS清洗2次。采用Lipofecta-mineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別將anti-NC(陰性對照)、anti-miR-217轉(zhuǎn)染至PBMC細(xì)胞，分別anti-NC組和anti-miR-217組；pcDNA3.1(陰性對照)、pcDNA3.1-Sirt1轉(zhuǎn)染至PBMC細(xì)胞，分為pcDNA3.1組和pcDNA3.1-Sirt1組。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)6 h，更換含10%AB血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3ELISA法檢測炎癥因子表達(dá) PBMC細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。參照TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10試劑盒操作說明，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中其表達(dá)水平。

1.2.4qRT-PCR檢測miR-217和Sirt1 mRNA表達(dá) 取各組細(xì)胞，加入Trizol試劑，提取總RNA。微量核酸儀檢測RNA純度的濃度。A260/A280的比值在1.8～2.0用于反轉(zhuǎn)錄。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，PCR試劑盒進(jìn)行擴增。擴增條件，95℃預(yù)變性5 min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行45個循環(huán)。miR-217以U6為內(nèi)參，Sirt1以GAPDH為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計算miR-217和Sirt1 mRNA的相對表達(dá)水平。

1.2.5Western blot檢測Sirt1蛋白表達(dá) 取各組細(xì)胞，加入RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白質(zhì)，加入上樣緩沖液，煮沸5 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入Sirt1抗體，4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜后，加入HPR標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。TBST洗膜后，滴加ECL顯影液，避光顯影。Bio-Rad Chemi DOC MP全能型成像分析系統(tǒng)拍照，以GAPDH為內(nèi)參，分析蛋白條帶灰度值。

1.2.6雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?PBMC細(xì)胞接種于24孔板中，細(xì)胞融合至50%時，更換無血清DMEM培養(yǎng)基。采用LipofectamineTM2000分別共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-Sirt1、MUT-Sirt1與miR-NC或miR-217 mimics。每組設(shè)置3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)6 h，更換含10%AB血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，按照雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炘噭┖胁僮髡f明書，檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1LPS誘導(dǎo)的PBMC細(xì)胞炎癥因子表達(dá) 以未受LPS誘導(dǎo)的PBMC作為對照，ELISA法檢測PBMC炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10 蛋白分泌水平。結(jié)果顯示，與對照組比，LPS刺激組PBMC細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白水平均顯著升高(P<0.05)，IL-10蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，說明LPS誘導(dǎo)加劇了PBMC的炎癥反應(yīng)。見表1。

2.2LPS誘導(dǎo)的PBMC細(xì)胞中miR-217和Sirt1表達(dá) 以未受LPS誘導(dǎo)的PBMC細(xì)胞作為對照，qRT-PCR檢測PBMC細(xì)胞中miR-217和Sirt1 mRNA表達(dá)，Western blot檢測Sirt1 蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組比，LPS誘導(dǎo)組PBMC細(xì)胞中miR-217表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Sirt1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低，說明LPS刺激后，PBMC中miR-217呈高表達(dá)，Sirt1呈低表達(dá)(P<0.05)。見圖1。

2.3下調(diào)miR-217表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的PBMC細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染anti-NC、anti-miR-217至PBMC細(xì)胞，qRT-PCR檢測miR-217表達(dá)，結(jié)果顯示，anti-miR-217組PBMC細(xì)胞中miR-217表達(dá)水平顯著低于anti-NC組(P<0.05)，說明miR-217低表達(dá)的PBMC細(xì)胞構(gòu)建成功，見圖2。ELISA法檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與anti-NC組比，anti-miR-217組PBMC細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，IL-10蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，說明下調(diào)miR-217表達(dá)可抑制LPS誘導(dǎo)的PBMC細(xì)胞炎癥反應(yīng)，見表2。

GroupsTNF-αIL-1βIL-6IL-10Control1.21±0.570.43±0.120.53±0.145.13±0.92LPS6.59±1.112.17±0.851.39±0.622.16±0.45t12.9356.0814.0598.700P<0.001<0.0010.001<0.001

圖1 LPS對PBMC細(xì)胞中miR-217和Sirt1表達(dá)的影響Fig.1 Effect of LPS on expression of miR-217 and Sirt1 in PBMC cellsNote: Compared with control group, *.P<0.05.

2.4Sirt1過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的PBMC細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1、pcDNA3.1-Sirt1至PBMC細(xì)胞，Western blot檢測Sirt1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，pcDNA3.1-Sirt1組PBMC細(xì)胞中Sirt1蛋白水平顯著低于si-NC組(P<0.05)，說明Sirt1過表達(dá)的PBMC細(xì)胞構(gòu)建成功，見圖3。ELISA法檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與pcDNA3.1組比，pcDNA3.1-Sirt1組PBMC細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白水平顯著降低(P<0.05)，IL-10表達(dá)顯著升高(P<0.05)，說明Sirt1過表達(dá)可抑制LPS誘導(dǎo)的PBMC細(xì)胞炎癥反應(yīng)，見表3。

圖2 miR-217抑制劑轉(zhuǎn)染效果驗證Fig.2 Verification of transfection effect of miR-217 inhibitorNote: Compared with anti-NC group, *.P<0.05.

GroupsTNF-αIL-1βIL-6IL-10anti-NC6.46±1.092.11±0.831.41±0.582.04±0.44anti-miR-2171.35±0.640.59±0.150.61±0.175.01±0.86t12.1285.4063.9719.223P<0.001<0.0010.001<0.001

圖3 Sirt1過表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染效果驗證Fig.3 Verification of transfection effect of Sirt1 overex-prssion vectorNote: Compared with pcDNA3.1 group, *.P<0.05.

2.5miR-217靶向調(diào)控Sirt1表達(dá) Target Scan靶基因預(yù)測工具顯示，Sirt1基因的3′-UTR區(qū)域存在miR-217的結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示，WT-Sirt1+miR-217組PBMC細(xì)胞熒光素酶活性顯著低于WT-Sirt1+miR-NC組(P<0.05)，而MUT-Sirt1+miR-217組與MUT-Sirt1+miR-NC組熒光素酶活性無顯著差異(P>0.05)，說明miR-217靶向調(diào)控Sirt1表達(dá)。分別將miR-217 mimics、anti-miR-217轉(zhuǎn)染至PBMC細(xì)胞，Western blot檢測Sirt1蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，miR-217組PBMC細(xì)胞中Sirt1蛋白表達(dá)顯著低于miR-NC組(P<0.05)，anti-miR-217組PBMC細(xì)胞中Sirt1蛋白表達(dá)顯著高于anti-NC組(P<0.05)，說明miR-217在PBMC細(xì)胞中負(fù)向調(diào)控Sirt1表達(dá)。見圖4。

表4 下調(diào)Sirt1表達(dá)降低了下調(diào)miR-217對LPS誘導(dǎo)的PBMC中炎癥因子表達(dá)的影響

Tab.4 Down-regulating Sirt1 reduces effect of down-regulating miR-217 on expression of inflamma-tory factors in LPS-induced PBMC

GroupsTNF-α(ng/ml)IL-1β(ng/ml)IL-6(ng/ml)IL-10(ng/ml)LPS+anti-miR-217+si-NC1.28±0.640.57±0.130.69±0.195.06±0.87LPS+anti-miR-217+si-Sirt15.46±0.972.05±0.761.29±0.483.57±0.52t10.7915.7583.4874.410P<0.001<0.0010.003<0.001

2.6上調(diào)miR-217表達(dá)抑制了Sirt1過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的PBMC中炎癥因子表達(dá)的影響 分別將miR-NC、miR-217 mimics與pcDNA3.1-Sirt1共轉(zhuǎn)染至PBMC細(xì)胞，qRT-PCR檢測miR-217表達(dá)，結(jié)果顯示，miR-217+pcDNA3.1-Sirt1組PBMC細(xì)胞中miR-217表達(dá)顯著高于miR-NC+pcDNA3.1-Sirt1組(P<0.05)，見圖5。ELISA法進(jìn)一步檢測兩組PBMC細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與miR-NC+pcDNA3.1-Sirt1組相比，miR-217+pcDNA3.1-Sirt1組PBMC細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，IL-10表達(dá)顯著降低(P<0.05)，說明上調(diào)miR-217表達(dá)可降低Sirt1過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的PBMC細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的影響，見表4。

3 討論

RA是一種自身免疫性疾病，目前，其發(fā)病原因尚不十分清楚，普遍認(rèn)為其發(fā)生與機體炎癥反應(yīng)、免疫功能紊亂等因素關(guān)系密切[12]。miRNA可通過與靶mRNA結(jié)合，降解或抑制靶mRNA翻譯，在細(xì)胞發(fā)育、增殖、凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。研究顯示，大量miRNA在RA患者機體內(nèi)異常表達(dá)，參與RA疾病的發(fā)生、發(fā)展[13-15]。通過調(diào)控miRNA干預(yù)網(wǎng)絡(luò)，可影響RA炎癥、免疫、疼痛等多種病理過程，是治療RA的新思路[16]。彭桉平等[17]發(fā)現(xiàn)雷公藤內(nèi)酯醇可通過抑制miR-155表達(dá)下調(diào)LPS誘導(dǎo)的RA患者單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)。朱亞梅等[18]研究發(fā)現(xiàn)清絡(luò)通痹方可能通過影響膠原性關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠miR-143等miRNA的表達(dá)，參與CIA炎癥、免疫等過程，是治療RA的潛在方法。探討RA患者機體內(nèi)異常表達(dá)的miRNA及其作用機制，有助于深入了解RA的發(fā)病機制，為其治療提供新的策略。

miR-217定位于人2號染色體，參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。徐建等[19]研究發(fā)現(xiàn)miR-217在食管鱗癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)其表達(dá)可抑制食管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。劉宇等[20]研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中miR-217表達(dá)紊亂，miR-217參與內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。目前，miR-217在RA中的研究尚未有報道。細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)時，促炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6分泌增加，抗炎因子IL-10分泌減少[21]。本研究分離了RA患者PBMC細(xì)胞，采用LPS誘導(dǎo)PBMC細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，以未受LPS誘導(dǎo)的PBMC細(xì)胞作為對照，ELISA法檢測結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)后，PBMC細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6分泌水平升高，IL-10分泌水平降低，說明LPS誘導(dǎo)PBMC細(xì)胞產(chǎn)生了炎癥反應(yīng)。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)后，PBMC細(xì)胞中miR-217呈高表達(dá)，提示miR-217參與PBMC細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。通過轉(zhuǎn)染anti-miR-217至PBMC細(xì)胞，下調(diào)miR-217表達(dá)后，LPS誘導(dǎo)的PBMC細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6分泌水平降低，IL-10分泌水平升高，說明下調(diào)miR-217表達(dá)可抑制RA患者PBMC細(xì)胞炎癥反應(yīng)，miR-217是RA治療的潛在靶點。

通過miRNA靶標(biāo)預(yù)測軟件顯示，Sirt1基因的3′-UTR區(qū)域存在miR-217的結(jié)合位點，miR-217可能調(diào)控Sirt1表達(dá)。Sirt1是一種蛋白去乙酰化酶，定位于細(xì)胞核，可通過抑制核因子κB(NF-κB)的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生[22]。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的PBMC細(xì)胞中Sirt1 mRNA和蛋白均表達(dá)下調(diào)，與蔡國偉等[23]報道的RA患者膝關(guān)節(jié)滑膜組織Sirt1蛋白表達(dá)減少的結(jié)果一致，提示Sirt1在RA疾病的發(fā)生和發(fā)展過程發(fā)揮重要作用。本研究雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-Sirt1與miR-217的PBMC細(xì)胞熒光素酶活性顯著共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-Sirt1與miR-NC的PBMC細(xì)胞，而共轉(zhuǎn)染MUT-Sirt1與miR-217的PBMC細(xì)胞熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染MUT-Sirt1與miR-NC的PBMC細(xì)胞無明顯差異，證實miR-217在PBMC細(xì)胞中可靶向調(diào)控Sirt1表達(dá)。這與俞峰等[24]報道的高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中miR-217靶向調(diào)控Sirt1表達(dá)結(jié)果一致。進(jìn)一步將miR-NC、miR-217 mimics轉(zhuǎn)染至PBMC細(xì)胞，Western blot檢測結(jié)果顯示，miR-217組PBMC細(xì)胞中Sirt1蛋白表達(dá)顯著低于miR-NC組，說明miR-217在PBMC細(xì)胞中負(fù)向調(diào)控Sirt1表達(dá)。ELISA法檢測結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)后，Sirt1過表達(dá)的PBMC細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白水平顯著降低，IL-10蛋白水平顯著升高，說明Sirt1過表達(dá)可抑制LPS誘導(dǎo)的PBMC細(xì)胞炎癥反應(yīng)。而與共轉(zhuǎn)染miR-NC與pcDNA3.1-Sirt1的PBMC細(xì)胞相比，共轉(zhuǎn)染miR-217與pcDNA3.1-Sirt1的PBMC細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白水平顯著升高，IL-10蛋白水平顯著降低，說明上調(diào)miR-217表達(dá)可降低Sirt1過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的PBMC細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的影響，提示下調(diào)miR-217可能通過調(diào)控Sirt1表達(dá)抑制RA患者PBMC細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

綜上所述，miR-217在LPS誘導(dǎo)的RA患者PBMC細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)miR-217表達(dá)可能通過調(diào)控Sirt1表達(dá)抑制PBMC細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，為RA的臨床治療提供了潛在靶點。