潘宇晨 李京蔓 李 丹 竇 環(huán) 侯亞義 (南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院,南京 210093)

惡性黑色素瘤是最嚴(yán)重的一種皮膚癌，難以根治。盡管免疫檢查點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)推動(dòng)了腫瘤免疫療法的進(jìn)步，但腫瘤免疫療法仍有很多不足之處[1，2]。個(gè)體化的腫瘤疫苗提高了腫瘤的治療效果，并有效地防止其復(fù)發(fā)[3]，但由于制備時(shí)間久、成本較高，其應(yīng)用受到較大限制。因此，開發(fā)更有效更經(jīng)濟(jì)的方法來輔助治療黑色素瘤是非常重要的。

巨噬細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)中被廣泛研究的具有異質(zhì)性的細(xì)胞，是機(jī)體抵抗感染的重要組成部分。巨噬細(xì)胞通過分泌炎癥因子[如腫瘤壞死因子(TNF-α)]、產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)(如產(chǎn)生一氧化氮、活性氧等)能夠抑制腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移，并通過吞噬作用消除惡性腫瘤細(xì)胞[4]。先前的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，活化巨噬細(xì)胞并促進(jìn)其向促炎的M1型極化有利于黑色素瘤小鼠的治療[5]。

鹿血晶(deer blood crystal,DBC)由鹿血制得，富含多糖、氨基酸、微量元素等。近年來發(fā)現(xiàn)鹿血具有治療貧血、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、延緩衰老、改善記憶、抗疲勞、改善性功能等多種治療保健作用[6]。本文旨在研究鹿血晶對巨噬細(xì)胞殺傷黑色素瘤的影響及潛在的分子機(jī)制，為臨床中藥聯(lián)合腫瘤治療的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 鹿血晶凍干粉來自蘇州紅冠莊國藥股份有限公司(批號(hào)：S1810012)；B16F10細(xì)胞株和Raw264.7細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、雙抗均購自上海基峰生物科技有限公司；CCK8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；凋亡試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Trizol、qRT-PCR mix購自賽默飛世爾科技有限公司(Thermo Fisher Scientific)；NO試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA檢測試劑盒購自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；β-actin、p-S6、S6、p-4EBP、4EBP抗體購自CST公司(Cell Signaling Technology)；兔二抗購自碧云天生物技術(shù)有限公司，流式抗體F4/80購自福麥斯生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) Raw264.7及B16F10細(xì)胞均種于90% DMEM+10% 胎牛血清的培養(yǎng)基中，5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2CCK8檢測 取100 μl 細(xì)胞懸液加至96孔板，培養(yǎng)過夜。細(xì)胞貼壁后加不同濃度的鹿血晶溶液或巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清培養(yǎng)，24 h后棄上清并用無菌PBS洗板3次，每孔加90% DMEM+10% CCK8溶液100 μl，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至顏色變橙，酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光值(A450)。細(xì)胞活力計(jì)算方式：細(xì)胞活力指數(shù)=[A450(加藥)-A450(空白)]/[A450(未加藥)-A450(空白)]。

1.2.3RNA提取與qRT-PCR 根據(jù)說明書使用Trizol法提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以β-actin為內(nèi)參，各基因相對表達(dá)量由公式2-ΔΔCt計(jì)算得出。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù) B16F10-GFP與Raw264.7以2∶1比例鋪板，貼壁后加不同濃度鹿血晶處理24 h，胰酶消化并收集細(xì)胞，4℃，1 500 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗2次，加F4/80抗體避光孵育15 min，加1 ml PBS清洗1遍，上機(jī)檢測。凋亡檢測按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞，加RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解15～30 min，4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清。BCA法檢測上清總含量，加相應(yīng)體積5×蛋白上樣緩沖液，混勻后，99℃金屬浴10 min。蛋白保存至-80℃冰箱或冷卻至室溫上樣。等量蛋白樣品使用15%聚丙酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5% BSA-TBST緩沖液室溫封閉1 h，一抗4℃搖床孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。移至曝光儀中，加曝光液顯影并拍照。

1.2.6ELISA實(shí)驗(yàn) 收集不同組細(xì)胞上清，按照ELISA試劑盒說明書步驟操作，酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm處吸光度值，利用標(biāo)曲計(jì)算出NO和各炎癥因子的含量。

2 結(jié)果

2.1鹿血晶處理巨噬細(xì)胞后其上清降低黑色素瘤細(xì)胞活力 單加鹿血晶低(250 mg/ml)、中(500 mg/ml)、高(1 000 mg/ml)三個(gè)濃度均略微增強(qiáng)B16F10的細(xì)胞活力，不加鹿血晶的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清對B16F10細(xì)胞活力影響不大，而加了鹿血晶之后巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)上清能夠顯著抑制B16F10的細(xì)胞活力(P<0.05)(圖1)。

2.2鹿血晶處理巨噬細(xì)胞后其上清促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，單獨(dú)鹿血晶能夠促進(jìn)B16F10早期凋亡，不影響其晚期凋亡(圖2A～C)，而中、高濃度鹿血晶處理后的巨噬細(xì)胞上清顯著提高B16F10的早期凋亡和晚期凋亡(P<0.05)(圖2D～F)。

2.3鹿血晶促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬黑色素瘤細(xì)胞 巨噬細(xì)胞Raw264.7與帶GFP熒光標(biāo)簽的B16F10共培后，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，不同濃度鹿血晶處理組巨噬細(xì)胞(F4/80+)的綠色熒光平均熒光強(qiáng)度高于對照組，結(jié)果顯示鹿血晶能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞對黑色素瘤細(xì)胞的吞噬作用，且呈劑量依賴性(P<0.05)(圖3)。

圖1 鹿血晶處理后巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清抑制B16F10細(xì)胞活力Fig.1 Supernatant of Raw264.7 treated with Deer blood crystal inhibits the cell viability of B16F10Note: Sup.Supernatant of Raw264.7 cells.Data are shown as

圖2 鹿血晶處理后巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清促進(jìn)B16F10細(xì)胞凋亡Fig.2 Supernatant of Raw264.7 treated with Deer blood crystal promotes apoptosis of B16F10Note: Sup:supernatant of Raw264.7 cells.Data are shown as (n=3).*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001.

圖3 鹿血晶促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬B16F10細(xì)胞Fig.3 Deer blood crystal promotes phagocytosis of Raw264.7 to B16F10Note: Data are shown as

2.4鹿血晶促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子 結(jié)果顯示，低、中、高濃度的鹿血晶均能夠顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞活力(圖4A)。鹿血晶處理后的巨噬細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了變化，胞體增大、偽足伸長、呈樹突狀，且隨鹿血晶濃度的增高巨噬細(xì)胞形態(tài)變化越明顯(圖4B)，說明鹿血晶能夠激活巨噬細(xì)胞向炎癥形態(tài)變化。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，鹿血晶不會(huì)促進(jìn)巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡(圖4C)。

圖4 鹿血晶增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活力Fig.4 Deer blood crystal promotes cell viability of Raw264.7 cellsNote: Data are shown as

有文獻(xiàn)表明[7,8]，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的抗腫瘤活性，增強(qiáng)TNF-α、IL-6等炎癥因子的分泌有利于腫瘤的治療。本研究發(fā)現(xiàn)，低、中、高三個(gè)濃度的鹿血晶處理3 h后均能夠上調(diào)巨噬細(xì)胞促炎因子iNOS、IL-1β、TNF-α的表達(dá)，而IL-6則在高濃度處理12 h時(shí)才顯著上調(diào)(圖5A～C)。此外，不同濃度鹿血晶均能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6，而僅有高濃度鹿血晶促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌一氧化氮(NO)和IL-1β(圖5D)。這些促炎因子均為M1型巨噬細(xì)胞高表達(dá)基因，也是M1型巨噬細(xì)胞主要分泌的炎癥因子。上述結(jié)果說明鹿血晶能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子從而殺傷腫瘤細(xì)胞。

圖5 鹿血晶促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子Fig.5 Deer blood crystal promotes expressions and secretion of inflammatory cytokinesNote: Data are shown as

圖6 鹿血晶活化巨噬細(xì)胞mTOR信號(hào)通路Fig.6 Deer blood crystal promotes phosphorylation of S6 and 4EBPNote: Data are shown as (n=3).*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001.

2.5鹿血晶活化巨噬細(xì)胞mTOR信號(hào)通路 文獻(xiàn)報(bào)道NO、IL-1β、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)均與mTOR信號(hào)通路的活化有關(guān)[9，10]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果則表明鹿血晶能夠顯著上調(diào)mTOR下游4EBP和S6的磷酸化水平(P<0.05)(圖6)。綜上，鹿血晶能夠活化巨噬細(xì)胞mTOR信號(hào)通路。

3 討論

巨噬細(xì)胞是腫瘤免疫療法的重要成員，近年來針對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macroph-age,TAM)的研究層出不窮，誘導(dǎo)TAM向M1型極化、恢復(fù)巨噬細(xì)胞吞噬能力、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用均有利于腫瘤的治療[11，12]。由于巨噬細(xì)胞移植到體內(nèi)后無法擴(kuò)增，所以如何調(diào)控患者自身體內(nèi)的巨噬細(xì)胞以對抗腫瘤顯得十分重要。

中藥廣泛應(yīng)用于腫瘤化療后患者恢復(fù)和化療相關(guān)癥狀的治療。有文獻(xiàn)報(bào)道，鹿血晶能夠治療乳腺浸潤導(dǎo)管癌患者化療后白細(xì)胞減少癥[13]，改善消化道腫瘤化療后骨髓功能[14]。但鹿血晶對機(jī)體免疫的直接作用尚不清楚，中藥在黑色素瘤方面的研究也非常匱乏。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，mTOR具有多種功能，是細(xì)胞代謝的中心調(diào)控因子[15，16]，腫瘤免疫抑制和抗增殖治療中也常靶向mTOR信號(hào)通路。有文獻(xiàn)報(bào)道，抑制mTOR信號(hào)通路能夠抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等[17]。

體外實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)鹿血晶不僅能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活力，還能夠活化mTOR信號(hào)通路，上調(diào)mTOR下游4EBP和S6的磷酸化水平，提高巨噬細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)水平，促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β和一氧化氮的分泌。含有上述炎癥因子的細(xì)胞上清能夠降低黑色素瘤細(xì)胞活力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。此外，鹿血晶還能提高巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的吞噬作用，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞清除腫瘤細(xì)胞的能力。

綜上所述，本文通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鹿血晶能夠活化巨噬細(xì)胞mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子，提升巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的吞噬、殺傷能力，為臨床應(yīng)用中藥調(diào)節(jié)免疫抵抗腫瘤提供了理論基礎(chǔ)。