梁莎莎，龐春英，鄧廷賢，馬小婭，陸杏蓉，段安琴，梁賢威

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，農(nóng)業(yè)部（廣西）水牛遺傳繁育重點實驗室，廣西南寧 530001）

水牛奶營養(yǎng)豐富，其乳脂肪、乳蛋白等主要營養(yǎng)物質(zhì)均高于牛奶或人奶[1]，被譽為“奶中之王”。乳脂是乳中重要組成成分，由約98%的甘油三酯和約1%的磷脂、少量的1,2-甘油二酯、膽固醇和游離脂肪酸等組成[2]。長鏈脂酞輔酶A 合成酶家族（Long-Chain Fatty Acyl-CoA synthetases，ACSLs）是哺乳動物利用脂肪酸活化催化生成酯酰輔酶A 過程中所必需的酶[3]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)哺乳動物ACSLs基因有5 種亞型，分別為ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5和ACSL6[4-5]。研究表明，ACSLs基因在甘油三酯、磷脂和膽固醇合成及脂肪酸代謝中具有重要作用[6]。Suzuki 等[7]和Abe等[8]研究發(fā)現(xiàn)高碳水化合物或高脂肪日糧會對ACSL1在肝臟中的表達(dá)產(chǎn)生影響。Hendrik 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，ACSL1在出生后至成年過程中的表達(dá)量逐漸增加。在HepG2 細(xì)胞中，過表達(dá)ACSL1導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量增加了40%，并且長鏈脂酞輔酶A 含量也增加了60%[10]。因此，ACSL1基因過表達(dá)后可以提高甘油三酯中油酸的沉積，增加脂肪在細(xì)胞內(nèi)的沉積量[3]，而脂肪的沉積可影響奶的風(fēng)味[11]。鑒于此，探究ACSL1基因?qū)χx相關(guān)基因表達(dá)水平的影響對未來生產(chǎn)出高品質(zhì)水牛奶具有重要意義。本實驗利用基因操作技術(shù)克隆出水牛ACSL1完整CDS 序列并構(gòu)建過表達(dá)載體和干擾片段，從而探究該基因?qū)θ橄偕掀ぜ?xì)胞中乳脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響，為今后進一步研究該基因在奶水牛乳腺脂肪酸代謝中的功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 3 頭48 月齡、體重約500 kg 的雌性泌乳期尼里水牛來自廣西水牛研究所種畜場，原代分離和培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞來自本實驗室。

1.2 主要試劑 骨架載體PCDNA3.1+、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、DMEM/F-12 細(xì)胞培養(yǎng)基、Lipofectamine 3000、Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑和PowerUp SYBR Green Master Mix 購自Thermo 公司；普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA 公司；PEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit 購自北京全式金生物科技有限公司；PureLink RNA Mini Kit、PremixTaq酶購自TaKaRa 公司，siRNA 干擾片段委托廣州銳博生物科技有限公司制備（表1）。

表1 siRNA 序列

1.3ACSL1不同組織表達(dá)量檢測 將水牛的共8 種組織的cDNA 稀釋至70～80 ng/μL，使用實時熒光定量PCR檢測ACSL1在不同組織中的表達(dá)情況，以GAPDH作為內(nèi)參。反應(yīng)體系為20 μL，其中PowerUp SYBR Green Master Mix 10 μL，Rnase water 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL；反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 個循環(huán)。

1.4ACSL1基因編碼區(qū)克隆及過表達(dá)載體構(gòu)建 采用一步克隆法設(shè)計引物，以NCBI 上預(yù)測的水牛ACSL1基因（登錄號：XM_006075115.2）為參考序列，以pcDNA3.1+為骨架載體，選取NotⅠ為酶切位點，擴增引物：F:5′-ATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCATGATGCAA GCCCACGAGC-3′；R：5′-GCCCTCTAGACTCGAGCG GCCGCTTAGACTTTGATGGTGGAG-3′。大體上講，以水牛乳腺組織cDNA 為模板進行PCR 擴增，PCR 反應(yīng)體 系50 μL：DNA 模 板1 μL，PremixTaq25 μL，上、下游引物各2 μL，dH2O 20 μL；PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35 個循環(huán)，72℃延伸8 min。取10 μL PCR 產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對目的片段進行膠回收后，產(chǎn)物與pcDNA3.1+載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)篩選挑菌培養(yǎng)后，委托華大基因進行測序。

1.5 水牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM+10%FBS，轉(zhuǎn)染前24 h，將水牛乳腺上皮細(xì)胞均勻接種于24 孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞密度達(dá)到約80%時，使用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染ACSL1過表達(dá)載體，使用Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染siRNA，具體步驟參照試劑盒說明書進行。本實驗設(shè)置過表達(dá)載體組（Ad-ACSL1）、過表達(dá)載體對照組（Ad-pcDNA3.1+）、干擾組（siRNA-ACSL1）和干擾對照組（siRNA-NC）4個處理組，每個處理組設(shè)置3 個重復(fù)，每個重復(fù)設(shè)置3個孔。

1.6ACSL1過表達(dá)及干擾對脂代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響檢測 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后收集，用PureLink RNA Mini Kit 試劑盒提取總RNA，通過電泳檢測RNA 的濃度和完整性，再使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 進行反轉(zhuǎn)錄實驗，反轉(zhuǎn)錄體系：RNA 模板1 μL，nuclease-free water 10 μL，5×Reaction Buffer 4 μL，dNTP Mix 2 μL，RiboLock 1 μL，RevertAid 1 μL，Oligo(dT) 1 μL，42℃ 60 min，cDNA 保存于-80℃。

用Primer 3.0 在線軟件設(shè)計脂代謝相關(guān)基因，其引物序列見表2。qPCR 反應(yīng)體系為20 μL：PowerUp SYBR Green Master Mix 10 μL，Rnase water 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL；反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，58℃ 30 s，40 個循環(huán)。

表2 實時定量PCR 引物

1.7 統(tǒng)計分析 使用GraphPad Prism 7 軟件對實驗結(jié)果進行分析及作圖，運用t檢驗對實驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析。將P≤0.05 作為顯著性水平。

2 結(jié)果

2.1 水牛ACSL1基因組織表達(dá)分析 由圖1 可知，水牛ACSL1基因在乳腺組織中的表達(dá)量顯著高于其他組織，其他組織的表達(dá)量從高到低依次為乳腺、淋巴、肝、心、大腸、腎、肺、垂體、子宮、輸卵管、卵巢、脾和大腦。

2.2 水牛ACSL1基因CDS 序列克隆及過表達(dá)載體構(gòu)建以水牛乳腺組織cDNA 為模板，進行PCR 擴增，產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，出現(xiàn)了1 個單一DNA條帶，片段大小為2 100 bp，與預(yù)測的片段大小一致（圖2），經(jīng)測序后與模板序列比對，相似性達(dá)99.95%；以pcDNA3.1+為骨架載體，選取NotⅠ為酶切位點進行酶切，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)篩選挑菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒（圖3）。

2.3ACSL1過表達(dá)對脂代謝相關(guān)基因的影響 如圖4 所示，與對照組（Ad-pcDNA3.1+）相比實驗組（Ad-ACSL1）細(xì)胞中ACSL1表達(dá)量極顯著上升(P＜0.001)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染ACSL1過表達(dá)載體與對照組差異極顯著。由圖5 可知，ACSL1基因過表達(dá)后，細(xì)胞中CLIC1、ELOVL1和PNPLA2等3 個基因顯著上升、ELOVL6表達(dá)量則極顯著上升，而CPT1B、CPT1C和DDR1表達(dá)量極顯著上升（P＜0.001），但FADS2差異不顯著。

2.4ACSL1干擾對脂代謝相關(guān)基因的影響 如圖6 所示，與對照組（siRNA-NC）相比，實驗組（siRNA-ACSL1）細(xì)胞中ACSL1表達(dá)量極顯著下降(P＜0.01)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染ACSL1干擾片段及其對照后的表達(dá)情況。由圖7 可知，ACSL1基因敲低后，細(xì)胞中ELOVL1和FADS2表達(dá)量顯著下降，而CLIC1、CPT1C、ELOVL6、DDR1和PNPLA2表達(dá)量極顯著下降，但CPT1B差異不顯著。

3 討 論

長鏈酯酰輔酶A 合成酶家族（ACSLs）是脂肪酸代謝中至關(guān)重要的酶，它們以長鏈脂肪酸（C12-C22）、ATP 和COA 作為底物，生成長鏈酯酰輔酶A 酯而參與各種脂類代謝[12]。ACSLs 基因家族的成員在不同組織中的表達(dá)及作用各不相同[13]，ACSL1一般在與能量代謝有關(guān)的組織（如肝臟、脂肪和肌肉組織）中高表達(dá)[14]，在對人HepG2 細(xì)胞、小鼠原代肝細(xì)胞、肝臟組織、脂肪細(xì)胞以及脂肪組織的研究中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ACSL1有助于脂肪酸轉(zhuǎn)運和甘油三酯的沉積[15-17]，并且ACSL1是脂酰CoA 合成甘油三酯最重要的合成酶[14]。Bionaz 等[18]發(fā)現(xiàn)，ACSL1基因奶牛泌乳高峰期乳腺中的表達(dá)量極顯著上升，乳汁中甘油三酯水平也急劇上升。本研究的組織表達(dá)分析結(jié)果也進一步顯示，該基因在乳腺組織中的表達(dá)量最高，暗示該基因可能與泌乳期水牛乳脂合成有關(guān)。

在奶牛乳腺組織中，乳脂合成的主要過程為脂肪酸的分解與攝入、脂肪酸的激活與轉(zhuǎn)運、脂肪酸的合成、三酰甘油的合成、乳脂滴形成和乳脂合成相關(guān)的調(diào)節(jié)因子[19]。CPT1B和CPT1C是CPT1家族中十分重要的成員，CPT1B參與脂肪酸的分解供能調(diào)控，CPT1C是脂肪酸分解代謝主要途徑β-氧化的限速酶[20]，CPT1能催化脂酰輔酶A 生成脂酰肉毒堿，通過調(diào)節(jié)長鏈脂肪酸進入線粒體進行β-氧化，從而為機體提供能量，并減少脂肪沉積[21]。過表達(dá)ACSL1后，CPT1B基因表達(dá)量均極顯著上升，因此推測，在水牛乳脂合成過程中，隨著ACSL1表達(dá)量上升，有可能使脂肪酸分解供能的活動增加。FADS2是多不飽和脂肪酸合成過程中的限速酶，敲除FADS2基因小鼠體格比野生型小鼠小10%～15%，體重瘦20%～25%[22]。本研究同時也發(fā)現(xiàn)干擾ACSL1后，F(xiàn)ADS2表達(dá)量顯著下降。由此推測，隨著ACSL1基因表達(dá)量下降，有可能影響多不飽和脂肪酸的合成。DDR1的功能與生長發(fā)育有關(guān)，是乳腺導(dǎo)管形態(tài)發(fā)生過程中結(jié)構(gòu)上皮的關(guān)鍵介質(zhì)，DDR1基因敲除小鼠表現(xiàn)為胚胎植入和乳腺發(fā)育缺陷[23]。CLIC1參與細(xì)胞跨膜物質(zhì)的運輸，ELOVL1和ELOVL6參與脂肪酸的延伸，PNPLA2作用于催化脂肪細(xì)胞中甘油三酯脂解的起始步驟，將甘油三酯轉(zhuǎn)化為二酰甘油，PNPLA2基因敲除的小鼠由于脂肪細(xì)胞甘油三酯水解的速率受損，脂肪組織質(zhì)量增加[24]。本研究中，無論過表達(dá)或干擾ACSL1，CLIC1、CPT1C、ELOVL1、ELOVL6、DDR1和PNPLA2的表達(dá)量都隨之極顯著上升和下降。因此推測，ACSL1在乳腺上皮細(xì)胞的表達(dá)量多少有可能影響水牛乳腺的生長發(fā)育狀況、水牛乳脂合成過程中乳腺細(xì)胞跨膜物質(zhì)運輸、脂肪酸分解代謝、減少脂肪酸延伸，降低細(xì)胞中甘油三酯水解速率。綜上所述，ACSL1基因可影響水牛乳腺上皮細(xì)胞中部分脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)量變化，從而影響水牛乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯的合成。

4 結(jié) 論

本實驗成功構(gòu)建了水牛ACSL1過表達(dá)載體并合成了干擾片段。組織表達(dá)分析結(jié)果顯示水牛ACSL1基因在乳腺組織中的表達(dá)量最高；在乳腺上皮細(xì)胞中過表達(dá)和干擾ACSL1后結(jié)果顯示，ACSL1基因可影響水牛乳腺上皮細(xì)胞中部分脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)量變化。本研究為進一步探討水牛及其他物種ACSL1基因的功能提供了理論基礎(chǔ)。