刁志祥，王旭堂，張培楊，王 波，謝愷舟*

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009；3.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs）在治療和預(yù)防細(xì)菌和原蟲(chóng)感染中發(fā)揮了重要作用，也因其具有促生長(zhǎng)的作用而被添加在動(dòng)物飼料中[1]，但過(guò)量使用會(huì)在動(dòng)物源性食品中大量殘留，其致癌作用以及使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性等嚴(yán)重威脅著人類健康[2-3]。SAs 包括磺胺胍（Sulfa guanidine，SG）、磺胺嘧啶（Sulfadiazine，SDZ）、磺胺間甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine，SMM）、磺胺二甲基嘧啶（Sulfamethazine，SMZ）、磺胺噻唑（Sul fathiazole，ST）、磺胺異噁唑（Sulfisoxazole,SIZ）、磺胺喹噁啉（Sulfaquinoxaline，SQ）、磺胺二甲氧嘧啶（Sulfadimoxine，SDM）等。

β-受體激動(dòng)劑（Beta-Agonists，BAAs）在畜牧生產(chǎn)中被廣泛用作生長(zhǎng)促進(jìn)劑，具有增加動(dòng)物瘦肉量、提高飼料利用率、減少上市天數(shù)等優(yōu)點(diǎn)[4]。人類食用高β-受體激動(dòng)劑殘留的動(dòng)物組織會(huì)出現(xiàn)肌肉震顫疼痛、惡心頭暈等癥狀，重則威脅生命。BAAs 主要包括鹽酸克倫特羅（Clenbuterol Hydrochloride，CLN）、萊克多巴胺（Ractopamine，RAC）、沙丁胺醇（Salbutamol，STL）、馬布特羅（Mabuterol，MBT）、特布他林（Terbutaline，TBT）、齊帕特羅（Zipater，ZPT）等。

歐盟[5]、美國(guó)[6]和中國(guó)[7]對(duì)動(dòng)物源性食品中SAs和BAAs 最高殘留限量（Maximum Residue Limits，MRLs）均作出了規(guī)定（表1）。隨著色譜質(zhì)譜技術(shù)飛速發(fā)展，獸藥殘留檢測(cè)已具有較低的檢測(cè)限（Limit of Detection，LOD）和定量限（Limit of Quantification，LOQ），但難以獲得較高的回收率，且多種藥物同時(shí)檢測(cè)的難度較大，因此今后的研究過(guò)程中還應(yīng)不斷開(kāi)發(fā)新的色譜和質(zhì)譜檢測(cè)法和樣品前處理方法，以便盡可能快速、便捷檢測(cè)動(dòng)物性食品中藥物的殘留，減小分析復(fù)雜樣品基質(zhì)時(shí)基質(zhì)效應(yīng)的影響。本文綜述了2 種藥物的色譜質(zhì)譜檢測(cè)方法，以期為動(dòng)物源性食品中獸藥殘留檢測(cè)新方法的建立提供理論基礎(chǔ)。

1 氣相色譜法

氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）是分析揮發(fā)性和半揮發(fā)性化合物的復(fù)雜混合物的一種成熟和高度可靠的技術(shù)[8]。無(wú)數(shù)相關(guān)的色譜柱化學(xué)、進(jìn)樣技術(shù)和檢測(cè)器提供了良好的選擇性和靈敏度，可以解決環(huán)境、能源、臨床、食品和藥物研究中的眾多問(wèn)題。

Chiavarino 等[9]將9 種磺胺類藥物轉(zhuǎn)化為其N1甲基化衍生物，經(jīng)毛細(xì)管氣相色譜分離，再利用原子發(fā)射檢測(cè)器同時(shí)測(cè)定，最終得出原子發(fā)射檢測(cè)器作為GC 檢測(cè)方法的使用表現(xiàn)出了明顯優(yōu)勢(shì)，顯著提高了線性范圍且降低方法的LOD，可有效檢測(cè)生物基質(zhì)中磺胺類藥物殘留的分析。李明等[10]利用CLN 含有2 個(gè)電負(fù)性很強(qiáng)的氯原子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，使用電子捕獲檢測(cè)器（Electron Capture Detector，ECD）進(jìn)行氣相色譜法分析，具有很高的靈敏度，平均回收率＞60%，滿足獸藥殘留分析的要求。由于氣相法檢測(cè)藥物需要衍生化（如重氮甲基化等）過(guò)程較為繁瑣且不易控制，故報(bào)道較少。

表1 歐盟、美國(guó)和中國(guó)規(guī)定的動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物和β-受體激動(dòng)劑的最高殘留限量 μg/kg

2 氣相色譜-質(zhì)譜法

氣相色譜-質(zhì)譜法（Gas Chromatography-Mass Spec trometry，GC-MS）目前在化學(xué)成分的通用檢測(cè)、定量分析和化學(xué)成分鑒定的能力方面有很大的性能寬度。GC-MS 法常因其具備高靈敏度、低假陽(yáng)性率等特點(diǎn)，用作篩選后陽(yáng)性樣品的確證。

GC-MS 法對(duì)于SAs 的測(cè)定既靈敏又具有選擇性，在分析前需要對(duì)非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定的藥物進(jìn)行衍生化處理，這增加了總體分析時(shí)間，并可能導(dǎo)致分析技術(shù)錯(cuò)誤。Reeves[11]以選定的離子監(jiān)測(cè)方式制備和分析甲基酰胺基三氟乙?；苌铮摲椒梢栽谝合嗌V系統(tǒng)收集后快速篩查可疑的SAs，減少檢測(cè)工作量，有效加標(biāo)回收率高于50%。Liu 等[12]同時(shí)測(cè)定豬肉樣品中的3 種BAAs，測(cè)得豬肉加標(biāo)樣品中CLN、STL 和RAC 的回收率為85.5%～93.9%，豬肉樣品的LOD 為0.022～0.091 μg/kg，該方法簡(jiǎn)化了預(yù)處理程序，可同時(shí)提取多個(gè)樣品，提高了預(yù)處理效率。Ye 等[13]建立了豬肉中CLN 的GC-MS 快速分析方法，在優(yōu)化的條件下，LOD 為3.6 μg/kg，加標(biāo)回收率為97.4%～105.7%。GC-MS 法雖然可行，但是必須經(jīng)過(guò)復(fù)雜的前處理過(guò)程才能檢測(cè)，另外衍生化的過(guò)程中其產(chǎn)物很難控制，增加檢測(cè)難度，并不適合廣泛推廣使用。

3 液相色譜法

高效液相色譜法（High-Performance Liquid Chromato graphy，HPLC）具有更高的分離效率、靈敏度和分析速度。常用的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器（Ultraviolet Detector，UV）、熒光檢測(cè)器（Fluorescence Detector，F(xiàn)LD）、二極管陣列檢測(cè)器（Diode Array Detector，DAD）等。因打破了傳統(tǒng)液相色譜依靠重力使流動(dòng)相緩慢流過(guò)色譜柱，而用高壓輸液泵使流動(dòng)相流過(guò)色譜柱，這大大降低了固定相的粒度要求，提高分離效率。

Stoev 等[14]建立了HPLC-FLD 法定量測(cè)定10 種最常用SAs 及其衍生物的殘留量，加標(biāo)濃度為1、5、10 μg/kg 條件下，其平均回收率分別為64%、68% 和78%，SQ 的定量限為1 μg/kg，其余SAs 的定量限為0.5 μg/kg。Maudens 等[15]利用液-液萃取結(jié)合固相萃取，建立了HPLC-FLD 法同時(shí)測(cè)定蜂蜜中12 種SAs，LOD 和LOQ 分別在1～2 μg/L 和2～5 μg/kg，回收率在37%～67%。

Fredy 等[16]采用反相高效液相色譜-紫外檢測(cè)法測(cè)定牛肝臟中CLN 殘留濃度，采用C18 反相色譜柱，NaH2PO4：乙腈（85:15，V/V）為流動(dòng)相，試驗(yàn)得到牛肝臟樣品中加標(biāo)回收率為82.0%～111.7%，LOD 和LOQ 分別為0.20 μg/kg 和0.42 μg/kg。Yan 等[17]利用HPLC-UV 法檢測(cè)3 種β-受體激動(dòng)劑，在優(yōu)化的色譜條件下，3 種BAAs 在20 min 內(nèi)達(dá)到完全基線分離；線性范圍為0.2～50 μg/L，回收率在79.2%～91.9%。

不同樣品基質(zhì)中SAs 和BAAs 液相檢測(cè)方法比較見(jiàn)表2。液相色譜熒光檢測(cè)法具有較低的檢測(cè)限，但是該檢測(cè)方法只對(duì)熒光基團(tuán)有效，部分藥物必須要衍生化，以獲得檢測(cè)所需的熒光基團(tuán)。液相色譜紫外檢測(cè)法已成功應(yīng)用于豬肉、牛肉、雞肉等基質(zhì)中獲得了較好的分離度?？偟膩?lái)說(shuō)，檢測(cè)SAs 和BAAs 殘留使用C18 色譜柱較多，而紫外檢測(cè)法擁有較低的檢測(cè)限，但在加標(biāo)樣品回收率方面略不及熒光檢測(cè)器，但二極管陣列檢測(cè)器同樣在回收率方面有較好的表現(xiàn)，它可以得到光譜和色譜結(jié)合的三維圖譜，適合用于復(fù)雜樣品的定性定量分析。

4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（High-Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLCMS）和超高效液相色譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，UPLC-MS）作為監(jiān)測(cè)動(dòng)物性食品組織獸藥殘留的重要手段，以LC 作為進(jìn)樣和分離裝置，MS 作為檢測(cè)器來(lái)對(duì)基質(zhì)中的化學(xué)成分定性定量。經(jīng)色譜分離后的各組分會(huì)被電離成不同荷質(zhì)比的離子，經(jīng)電場(chǎng)作用分開(kāi)，最終聚焦獲得質(zhì)譜圖。大多數(shù)藥物可以通過(guò)LC-MS 技術(shù)檢測(cè)，而MS 提供了檢測(cè)復(fù)雜組織提取物中目標(biāo)分析物所需的高特異性，該法兼具LC 的高分離能力和MS 的分析能力。

表2 不同樣品基質(zhì)中磺胺類藥物和β-受體激動(dòng)劑液相檢測(cè)方法的比較

Titus 等[34]采用支撐液膜凈化富集技術(shù)，結(jié)合HPLC-MS 同時(shí)測(cè)定加標(biāo)牛奶和牛肝、腎組織中的16種SAs 殘留，其中SDZ 等未能被有效捕獲，加標(biāo)樣品中SG 的回收率在77%～90%，SMM 的加標(biāo)回收率在55%～64%，該支撐液膜的高提取效率為這些化合物的殘留的測(cè)定提供了較好的選擇性和靈敏度。Verzegnassi等[35]建立了蜂蜜中10 種SAs 的反向HPLC-MS/MS 檢測(cè)法，為蜂蜜中10 種低濃度水平SAs 的定性確認(rèn)提供方法，所有藥物在50 μg/kg 的加標(biāo)水平下，平均回收率在44%～73%。

Sun 等[36]首次建立了免疫親和柱凈化，結(jié)合HPLCMS/MS 同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源性食品中RAC、氯霉素和玉米赤霉醇?xì)埩?，結(jié)果表明RAC 的加標(biāo)回收率為89.8%～99.0%，檢測(cè)限和定量限分別為0.009 μg/kg 和0.03 μg/kg，該方法具有較好的靈敏度且回收率高。Lin等[37]結(jié)合QuEChERS 技術(shù)，建立動(dòng)物肌肉和內(nèi)臟中β-受體激動(dòng)劑多殘留分析的HPLC-MS/MS 檢測(cè)新方法，結(jié)果證明加標(biāo)樣品中的平均回收率在70%～120%，LOQ為1 μg/kg，該方法簡(jiǎn)單快速，回收率高，降低分析時(shí)間且溶劑用量低。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)將色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性和明確的識(shí)別能力結(jié)合起來(lái)，由表3 可知其在檢測(cè)SAs 和BAAs 殘留方面發(fā)揮了重要作用，應(yīng)用也最為廣泛，相比于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，液質(zhì)聯(lián)用對(duì)那些分子量大、極性強(qiáng)、難氣化、熱穩(wěn)定性差的目標(biāo)物具有較好的分離檢測(cè)和定性定量能力，能提供復(fù)雜組織提取物中目標(biāo)分析物所需的高特異性，解決目標(biāo)物共流出問(wèn)題。隨著科技發(fā)展以及藥物分析的需求，分析技術(shù)的聯(lián)用已經(jīng)成為了分析化學(xué)發(fā)展的趨勢(shì)，聯(lián)用技術(shù)可以將不同技術(shù)的優(yōu)勢(shì)結(jié)合，使檢測(cè)結(jié)果更加的精準(zhǔn)。

表3 不同樣品基質(zhì)中磺胺類藥物和β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法的比較

5 展 望

隨著生活水平的不斷提高，消費(fèi)者對(duì)動(dòng)物食品安全越來(lái)越關(guān)注，這也就要求科研工作者們開(kāi)發(fā)出更加準(zhǔn)確、高效、重復(fù)性好的檢測(cè)方法來(lái)降低動(dòng)物源性食品中獸藥殘留檢測(cè)的檢測(cè)限和定量限，以保證人們身體健康和消除貿(mào)易壁壘。色譜質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)作為重要的化學(xué)分析法，在獸藥殘留分析中一直占據(jù)主導(dǎo)地位，現(xiàn)有的色譜質(zhì)譜檢測(cè)方法有很多，如GC-MS、HPLC-FLD、HPLCUV、HPLC-DAD、HPLC-MS/MS、UPLC-MS/MS 等。GC 和GC-MS 適用于低沸點(diǎn)、易揮發(fā)和熱穩(wěn)定性好的樣品，而GC 法檢測(cè)動(dòng)物源性食品中SAs 和BAAs 基本均須衍生化反應(yīng)，而衍生化過(guò)程繁瑣且不易控制，故使用較少。LC-MS/MS 法由于前處理方式、色譜柱、流動(dòng)相選擇與比例等不同，檢測(cè)水平存在差別，但總的來(lái)說(shuō)此法回收率都處在較高水平，滿足檢測(cè)需要，且避免了氣相色譜法檢測(cè)時(shí)需要衍生化的步驟，但是也存在一些缺點(diǎn)，如儀器成本高和存在豐富的基質(zhì)效應(yīng)，這可能會(huì)影響方法的定量和選擇性能。今后的研究方向應(yīng)致力于開(kāi)發(fā)集成化的全自動(dòng)前處理設(shè)備及色譜質(zhì)譜檢測(cè)設(shè)備聯(lián)用等方法，另外降低殘留檢測(cè)限和基質(zhì)效應(yīng)的干擾將成為今后研究的熱門方向。