渠國文，孫笑尉，龐全海

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 山西太谷 030801）

哺乳動物毛色形成是一個復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)，其形成的每一個水平都有各個調(diào)節(jié)因子互相作用來調(diào)控。其中研究最多的具有重要調(diào)控黑色素形成作用的基因為小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MIcrophthalmia-associated Transcription Factor，MITF），其作為黑色素合成主要信號通路下游關(guān)鍵因子，在色素細胞發(fā)育、分化和功能調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵性作用[1]。MITF 蛋白激活和調(diào)節(jié)3 種色素沉著酶基因，即酪氨酸酶（Tyr）、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（Tyrp1）和多巴色素-互變異構(gòu)酶（Dct/ Tyrp-2）[2-3]，促進真黑色素合成；MITF 蛋白含量降低時，可使黑色素細胞內(nèi)合成的Tyr 活性下降，產(chǎn)生褐黑色素[4]。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian Target of Rapamycin,mTOR）屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是哺乳動物信號傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵組成部分，調(diào)節(jié)生物體的生長、繁殖和哺乳動物的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)[5]。mTOR 通路是自噬領(lǐng)域的研究熱點，且近年來有研究表明自噬可調(diào)控黑色素細胞生成[6-8]。推測mTOR 可能在哺乳動物毛色形成方面具有調(diào)控作用。因此，探討mTOR 在不同毛色綿羊皮膚的表達與定位對深入了解mTOR 的生物學(xué)功能具有重要意義。本實驗以白色、棕色和黑色綿羊皮膚為實驗對象，采用qPCR 法檢測mTOR基因的相對表達量，Western blotting 技術(shù)檢測p-mTOR 蛋白的相對表達量，免疫組化技術(shù)對p-mTOR 進行定位，為進一步研究mTOR 在調(diào)控動物毛色中的作用機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及其組織 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)綿羊養(yǎng)殖基地隨機選取健康性成熟的白色、棕色和黑色哈薩克綿羊各3只，取背部皮膚組織各3 塊。其中2 塊放入液氮中用于提取RNA 和蛋白，1 塊直接放入4% 的組織細胞固定液中室溫固定48 h 后于70%的無水乙醇中存放。

1.2 主要試劑 RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）和TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）購自TaKaRa 公司；Anti-Phospho-MTORS2448 多克隆抗體、組織細胞裂解液、DAB 試劑盒染料、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、ECL Plus 超敏發(fā)光液、中性樹膠和4% 組織細胞固定液購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒、rabbit anti-β-actin 多克隆抗體和goat anti-rabbit IgG 購自北京三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 總RNA 提取及cDNA 的合成 使用RNAiso Plus試劑提取保存于液氮中白色、棕色和黑色綿羊皮膚組織的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，于-20℃冰箱中保存。

1.3.2 引物的設(shè)計與合成 參考GenBank 上已登錄的綿羊的mTOR和β-actinmRNA 序列，利用Primer Premier 6.0引物設(shè)計軟件設(shè)計熒光定量PCR 擴增引物，引物由華大基因（深圳）合成，引物序列如表1。

表1 引物序列及PCR 擴增條件

1.3.3 qRT-PCR 根據(jù)TB GreenTMPremix EX TagTMII 試劑盒建議反應(yīng)條件構(gòu)建反應(yīng)體系，每個樣本重復(fù)3 次，使用不添加模板的空白作陰性對照。反應(yīng)體系25 μL：TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）12.5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各1 μL，cDNA 模板2.0 μL和ddH2O8.5 μL。擴增條件：95℃變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s 共40 個循環(huán)，軟件自動得出擴增曲線、熔解曲線和循環(huán)閾值，分析所得結(jié)果。根據(jù)熒光曲線CT 值采用2-ΔΔCT計算定量結(jié)果。

1.3.4 Western boltting 分析 利用組織細胞蛋白提取試劑盒提取皮膚樣品的總蛋白，使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測其蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交、曝光得到蛋白印跡，使用Image-Pro Plus 6.0 蛋白分析軟件，分析mTOR 和β-actin 的印跡結(jié)果。Anti-Phospho-MTOR-S2448 抗體稀釋比例為1:300，rabbit anti-β-actin 抗體稀釋比例為1:2 000，Goat Anti-Rabbit IgG 稀釋比例為1:3 000。

1.3.5 免疫組化檢測 將置于樣品組織，經(jīng)梯度酒精（70%、75%、80%、85%、90%、95%和100%）脫水并使用二甲苯透明后進行包埋并制作切片。二甲苯和梯度酒精(100%、95%、90%、85%、80%、75%和70%)脫蠟，使用免疫組化試劑盒對烘干的組織切片進行實驗，Anti-Phospho-MTOR-S2448 抗體稀釋比例為1:100，陰性對照組使用PBS 代替一抗。DAB 顯色液顯色，在顯微鏡下觀察顏色變化，蘇木素復(fù)染、分化、透明后中性樹膠封片。使用ECLIPSE Ti-U 生物倒置顯微鏡對實驗結(jié)果進行拍照。

1.4 統(tǒng)計分析 使用GraphPadPrism 6 軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1mTOR在綿羊不同毛色皮膚組織中mRNA 的相對表達量 qRT-PCR 結(jié)果如圖1 所示，mTORmRNA 在棕色和黑色綿羊皮膚中表達量為白色綿羊皮膚中的6.7（P＜0.01）和23.8 倍（P＜0.001）；黑色綿羊皮膚中表達量為棕色綿羊皮膚中的3.6 倍（P＜0.01）。

2.2 不同毛色綿羊皮膚組織中p-mTOR 蛋白的表達量分析 Western blotting 檢測結(jié)果如圖2-A 所示，在綿羊不同毛色皮膚中見分子量大小約為289 ku 的蛋白；β-actin 作為內(nèi)參，其分子量約為42 ku。如圖2-B 所示，p-mTOR 蛋白在白色綿羊皮膚中的相對表達量顯著低于棕色和黑色綿羊皮膚中的相對表達量；黑色皮膚的表達量顯著高于棕色皮膚。

2.3 不同毛色綿羊皮膚組織中p-mTOR 蛋白的表達與定位 通過免疫組織化學(xué)法對p-mTOR 蛋白在不同毛色綿羊皮膚組織中的表達進行定位，結(jié)果如圖3 所示，p-mTOR 蛋白在皮膚組織的表皮、毛基質(zhì)、毛乳頭、根鞘部及毛干呈陽性表達，陰性對照組中未見陽性表達。

3 討 論

自噬通過磷酯酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/ AKT/ mTOR 信號傳導(dǎo)參與人表皮角質(zhì)形成細胞中異黃體生成素誘導(dǎo)的黑色素降解[9]。Yu-Tzu T 等[10]研究發(fā)現(xiàn)用扁柏酚處理B16F10 細胞后，扁柏酚以劑量依賴性方式降低MITF 和酪氨酸酶及細胞黑色素含量。同時，微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（LC3）-II 和beclin 1（自噬標記）增加，發(fā)現(xiàn)扁柏酚通過AKT/ mTOR信號通路抑制黑素生成[10]。研究表明，mTOR 信號傳導(dǎo)對于毛發(fā)（包括毛色）再生過程中毛囊干細胞的激活至關(guān)重要，其激活作用通過BMP 介導(dǎo)的毛發(fā)再生過程來實現(xiàn)[11]。本研究表明，mTOR基因在白色綿羊皮膚中的相對表達量顯著低于棕色和黑色綿羊，且黑色皮膚中的表達量顯著高于棕色皮膚，p-mTOR 蛋白在不同毛色綿羊皮膚中的相對表達量與mTOR基因有相同的趨勢，并與白色、棕色和黑色羊毛中的真黑色素含量趨勢相同[12]。

毛乳頭是向毛干和表皮提供黑色素的部位也是哺乳動物被毛產(chǎn)生色素的唯一場所，其中含有大量有活性的黑色素細胞，含有大量的黑色素顆粒輸出以供毛發(fā)生長時色素的沉積[13-14]。在不同毛色羊駝皮膚成熟黑色素細胞分布規(guī)律不同，在有色被毛皮膚組織中其主要分布在毛乳頭部，表皮分布較少；在白色被毛皮膚組織中大多分布在表皮而毛乳頭分布較少[15]。黑色素細胞的前體細胞即黑色素母細胞存在于毛根鞘中，成年小鼠黑色素母細胞在毛發(fā)周期中發(fā)育生成黑色素細胞。本研究利用免疫組織化學(xué)法對p-mTOR 蛋白在綿羊皮膚組織的表達進行了定位，p-mTOR 蛋白在皮膚組織的表皮、毛基質(zhì)、毛乳頭、根鞘部及毛干均有表達。由上可以推測mTOR參與動物毛色形成過程。

4 結(jié) 論

本實驗結(jié)果表明，mTOR基因在棕色和黑色綿羊皮膚中的相對表達量顯著高于白色綿羊皮膚，且在黑色綿羊皮膚中的相對表達量顯著高于棕色綿羊皮膚；p-mTOR 蛋白在白色、棕色和黑色綿羊皮膚中的相對表達量趨勢與mTOR基因相同；p-mTOR 蛋白在綿羊皮膚組織的表皮、毛基質(zhì)、毛乳頭、根鞘部及毛干表達，提示mTOR 與毛色的形成具有一定的相關(guān)性。