彭婉婉，許貴善,2*，馬忠杰，張皙藤，鳥鵬穎

（1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300）

新疆是少數(shù)民族群眾聚居區(qū)，對牛、羊肉等畜產(chǎn)品需求極大，但新疆尤其是南疆草地沙漠化嚴(yán)重，飼草資源短缺，飼料資源的開發(fā)和高效利用極其重要。新疆得天獨(dú)厚的種植條件使其成為世界上三大適宜葡萄栽培的黃金區(qū)域之一。葡萄釀酒加工過程中產(chǎn)生大量的葡萄渣，主要成分是葡萄皮和葡萄籽，約占鮮果重量的20%[1]。

前人研究表明，葡萄渣用于養(yǎng)殖可以提高肉羊的生產(chǎn)性能、屠宰性能和部分養(yǎng)分的可消化性[2-3]。葡萄渣作為飼料或添加劑極具利用價(jià)值，但其中所含的單寧對反芻動(dòng)物日糧蛋白質(zhì)的消化吸收和代謝具有抑制作用，是限制葡萄渣添加量的主要因素[4]。飼喂過量的葡萄渣會(huì)使動(dòng)物采食量下降，增加飼養(yǎng)成本，降低飼料養(yǎng)分的利用效率[5]。另外，葡萄渣中皮和籽的比例使其中的營養(yǎng)物質(zhì)含量波動(dòng)較大，研究結(jié)果不盡相同。葡萄籽營養(yǎng)物質(zhì)含量穩(wěn)定，但單寧含量較高，研究葡萄籽在肉羊飼料中的適宜添加量可為開發(fā)利用葡萄籽資源，提高蛋白質(zhì)利用效率提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

前人研究主要集中于葡萄渣，對葡萄籽添加比例的研究較少。本研究使用體外法探索葡萄籽在多浪羊全價(jià)日糧中的適宜添加量，以期為開展飼養(yǎng)試驗(yàn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為葡萄籽及葡萄渣等副產(chǎn)物在肉羊生產(chǎn)中的應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 瘤胃液供體動(dòng)物 瘤胃液供體動(dòng)物為16 只健康、體況良好、體重（33.0±3.2）kg 的多浪羊公羊（裝有永久性瘤胃瘺管，外徑9.8 cm，內(nèi)徑3.9 cm）。

1.2 試驗(yàn)飼糧與飼養(yǎng)管理 參照 NRC[6]（2007）配制體重為 30 kg、日增重為 150 g/d 綿羊營養(yǎng)需要量的全混顆粒飼料，由阿克蘇某飼料公司代為生產(chǎn)。每天09:00和21:00 各飼喂1 次，自由飲水，單欄飼養(yǎng)，飼喂15 d后于晨飼前采集瘤胃液。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)計(jì)了8 種飼料樣品，將育肥羊全價(jià)配合飼料粉碎過篩，葡萄籽來自新疆伊犁某葡萄酒廠，自然干燥后葡萄籽含水分9.93%，干物質(zhì)（DM）中含灰分3.02%、粗蛋白質(zhì)（CP）9.24%、粗脂肪16.25%、中性洗滌纖維60.52%、酸性洗滌纖維51.77%。葡萄籽自然干燥后用中草藥粉碎機(jī)粉碎過40 mm 篩孔，按0%、4%、8%、12%、16%、20%、24% 和28% 的比例分別添加至經(jīng)粉碎過40 mm 篩孔的育肥羊全價(jià)配合飼料中。

1.3.1 體外產(chǎn)氣試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取1.000 0 g 樣品倒入產(chǎn)氣瓶底部，每種飼料樣品過40 mm 篩稱3 個(gè)平行樣，試驗(yàn)設(shè)空白對照3 個(gè)（空白對照不放飼料樣品）。試驗(yàn)當(dāng)天于晨飼前采集瘤胃液，采集的瘤胃液用4 層紗布過濾，殘?jiān)亓鑫钢?，過濾后的瘤胃液裝在溫水預(yù)熱的暖瓶中迅速帶回試驗(yàn)室。人工唾液配制使用Menke 法[7]，人工唾液配制好后通入CO2，然后人工唾液和瘤胃液按2:1 比例混合成人工瘤胃液，每個(gè)產(chǎn)氣瓶中倒入100 mL人工瘤胃液，在瓶口通入CO2，迅速蓋上蓋子，放到39℃恒溫?fù)u床中，連接體外產(chǎn)氣監(jiān)測系統(tǒng)（ANKOM，RFS 產(chǎn)氣測量系統(tǒng)），記錄時(shí)間頻率設(shè)為0.5 h/次。

1.3.2 尼龍袋體外發(fā)酵試驗(yàn) 稱取1.3 g 左右樣品，裝入孔徑為50 μm，8 cm×6 cm 的尼龍袋中，系口后稱重。將7 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的21 個(gè)尼龍袋一次性投入4 L 的發(fā)酵罐內(nèi)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3 個(gè)平行樣用尼龍繩系在一起，留線固定在瓶身外側(cè)，便于取出。人工瘤胃液配制同體外產(chǎn)氣試驗(yàn)，每個(gè)發(fā)酵罐中倒入1 000 mL 人工瘤胃液，瓶口通入CO2，迅速蓋上蓋子，放入39℃紅外線加熱、自動(dòng)旋轉(zhuǎn)的瘤胃體外模擬裝置（ANKOM Daisy 自動(dòng)體外培養(yǎng)箱）中，模擬瘤胃內(nèi)環(huán)境及蠕動(dòng)過程。在發(fā)酵后2、4、8、12、24、36、48 h 從發(fā)酵罐中快速取出尼龍袋，取樣時(shí)通入CO2保持發(fā)酵罐內(nèi)厭氧環(huán)境。

1.4 樣品的采集及處理

1.4.1 體外產(chǎn)氣試驗(yàn)樣品采集及處理 發(fā)酵開始后第48小時(shí)停止試驗(yàn)，保存產(chǎn)氣數(shù)據(jù)，將產(chǎn)氣瓶快速放入冰水中，終止微生物活動(dòng)，測定發(fā)酵液的pH，然后將產(chǎn)氣瓶中的瘤胃液搖勻，取50 mL 瘤胃液于離心管中，1 500 ×g，39℃離心15 min，吸取4 mL 上清液于5 mL離心管中（預(yù)先加1 mL 1%的H2SO4溶液冷凍保存），用于測定氨態(tài)氮（NH3-N）濃度；取30 mL 上清液，用于測定菌體蛋白（MCP），所有樣品均保存在-20℃冰箱中。

表1 育肥羊全價(jià)配合飼料日糧營養(yǎng)配方及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4.2 尼龍袋體外發(fā)酵試驗(yàn)樣品采集及處理 在試驗(yàn)開始2、4、8、12、24、36、48 h 分別從每個(gè)發(fā)酵罐中取3 個(gè)尼龍袋，將尼龍袋在自來水下輕輕按壓，沖洗干凈，在65℃烘箱內(nèi)烘12 h，烘干后回潮24 h，用于測定干物質(zhì)降解率、粗蛋白質(zhì)降解率。取尼龍袋同時(shí)測發(fā)酵液的pH，吸取4 mL 瘤胃液于5 mL 離心管中（預(yù)先加1 mL 1% 的H2SO4溶液冷凍保存），-20℃冷凍保存，用于測定NH3-N 濃度，取樣過程要通入CO2保持厭氧環(huán)境。

1.5 樣品測定 使用ANKOM RFS 體外產(chǎn)氣監(jiān)測系統(tǒng)記錄產(chǎn)氣量；發(fā)酵液pH 使用FiveEasy FE22 pH 計(jì)；發(fā)酵液NH3-N 濃度采用馮宗慈比色法[8]；飼料中CP 含量使用凱氏定氮法[9]；發(fā)酵液中MCP 含量使用凱氏定氮法，取30 mL 瘤胃上清液4℃ 21 000×g 離心20 min，留沉淀，用15 mL 生理鹽水洗滌沉淀2 次，沉淀用10 mL 濃硫酸分3 次沖洗到消煮管中測定MCP 含量[10-11]。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

1.6.1 體外產(chǎn)氣試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 根據(jù)ANKOM 體外產(chǎn)氣監(jiān)測系統(tǒng)數(shù)據(jù)表的壓力值，換算成大氣壓下的產(chǎn)氣量，得到的產(chǎn)氣量減去空白對照的產(chǎn)氣量。產(chǎn)氣量計(jì)算公式：

GP=a+b×（1－e-ct）

式中，GP 為t 時(shí)刻的產(chǎn)氣量（mL/g DM）；a 為快速產(chǎn)氣部分產(chǎn)氣量（mL/g DM）；b 慢速產(chǎn)氣部分產(chǎn)氣量（mL/g DM）；c 為產(chǎn)氣速率（%/h）。

1.6.2 尼龍袋體外發(fā)酵試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 參照?skov 等[12]提出的瘤胃動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)營養(yǎng)物質(zhì)降解率和營養(yǎng)物質(zhì)有效降解率，計(jì)算公式：

dP=a+b ×（1－e-ct）；

ED=a+bc/（k+c）。

式中，dP 為待測飼料的營養(yǎng)物質(zhì)瘤胃某一時(shí)間點(diǎn)的降解率（%）；a 為快速降解部分含量（%）；b 為慢速降解部分含量（%）；c 為慢速降解部分的降解速率（%/h）；t 為瘤胃內(nèi)培養(yǎng)時(shí)間（h）；ED 為有效降解率（%）；k為瘤胃外流速率，本試驗(yàn)中k 值取0.021%/h[13]。

營養(yǎng)物質(zhì)在不同時(shí)間點(diǎn)的降解率計(jì)算公式：

A=100×（B－C）/B

式中，A 為待測飼料的所測營養(yǎng)物質(zhì)物質(zhì)某一時(shí)間點(diǎn)的消失率（%）；B 為待測樣品中所測營養(yǎng)物質(zhì)的含量（%）；C 為待測樣品尼龍袋殘?jiān)兴鶞y營養(yǎng)物質(zhì)含量（%）。

利用SAS 9.2 的非線性（NLIN）方程對產(chǎn)氣參數(shù)和降解參數(shù)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)采用SAS 9.2 軟件中的單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，LSD 多重比較差異，以P＜0.05 為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果用平均值和SEM 表示。

2 結(jié)果

2.1 添加不同比例的葡萄籽體外發(fā)酵48 h 的產(chǎn)氣量 由表2 可知，在產(chǎn)氣試驗(yàn)開始后的2、4、8、12 h，各組的產(chǎn)氣總量隨時(shí)間而增加，除24% 添加組2 h 產(chǎn)氣量與對照組有顯著差異外，其他各試驗(yàn)組2、4、8、12 h的產(chǎn)氣量和0%組差異均不顯著。隨著葡萄籽添加比例的增長，各組12、24、36、48 h 的產(chǎn)氣量先增長后減少，4%、8%、12% 和16% 添加組48 h 的潛在產(chǎn)氣量差異不顯著；16%添加組的潛在產(chǎn)氣量顯著高于各組，為121.03 mL/g。

表2 添加不同比例的葡萄籽體外發(fā)酵48 h 的產(chǎn)氣量

2.2 添加不同比例的葡萄籽體外發(fā)酵48 h 各時(shí)間點(diǎn)的干物質(zhì)降解率 如表3 所示，隨著飼料在人工瘤胃液中發(fā)酵時(shí)間的增加，干物質(zhì)的降解率增大；隨著葡萄籽添加比例增加，各組的干物質(zhì)降解率降低，0%添加組的干物質(zhì)有效降解率顯著高于16%、20%、24%組。

2.3 添加不同比例的葡萄籽體外發(fā)酵48 h 各時(shí)間點(diǎn)的粗蛋白質(zhì)降解率 由表4 可見，各時(shí)間點(diǎn)的粗蛋白質(zhì)降解率隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而增大；在發(fā)酵的2～24 h，各試驗(yàn)組的粗蛋白質(zhì)降解率與0%添加組無顯著差異。在發(fā)酵的36～48h，16%、20%和24%添加組粗蛋白降解率顯著低于0%添加組，0%、4%、8%、12%添加組粗蛋白降解率差異不顯著。16%、20% 和24% 添加組粗蛋白質(zhì)48 h 有效降解率顯著低于0%添加組。

2.4 添加不同比例的葡萄籽體外發(fā)酵各時(shí)間點(diǎn)的NH3-N、MCP 濃度及pH 表5 結(jié)果顯示，體外發(fā)酵8～48 h 發(fā)酵液的NH3-N 濃度隨著發(fā)酵時(shí)間的延長整體呈增長趨勢。從表6 可以看出，16% 添加組的NH3-N濃度最低，顯著低于0%添加組；隨著葡萄籽添加比例的增加，發(fā)酵液中MCP 濃度整體呈下降趨勢，12%、16%、20%、24%添加組MCP 濃度顯著低于0%添加組。隨著葡萄籽添加量的增加，發(fā)酵液pH 增高，除4%和8%添加組，各試驗(yàn)組的pH 顯著高于0% 添加組。由圖1可見，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵液的pH 降低，在發(fā)酵后的2～8 h，pH 降低速率較大。

3 討 論

3.1 葡萄籽添加比例對全價(jià)日糧體外產(chǎn)氣量的影響 碳水化合物和蛋白質(zhì)在瘤胃中被微生物降解產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸以及H2、CO2和甲烷等氣體，飼料在瘤胃中的產(chǎn)氣量能反映飼料被瘤胃微生物利用的程度。試驗(yàn)證明飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消化率與體外發(fā)酵的產(chǎn)氣量有較高相關(guān)性[14]。米熱古麗等[15]體外試驗(yàn)證實(shí)，葡萄籽精油能夠顯著提高發(fā)酵底物的總產(chǎn)氣量；張力莉等[16]研究表明，隨葡萄渣添加量的增加體外產(chǎn)氣量上升；張雪峰等[17]在發(fā)酵底物中添加20%的葡萄籽，72 h 產(chǎn)氣量顯著高于對照組；Chikwanha 等[18]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著日糧中葡萄渣比例的增加，羔羊45 d 平均日增重先增長后下降。本試驗(yàn)中添加不同比例葡萄籽后產(chǎn)氣量先增長后減少，16%添加組48 h 的有效產(chǎn)氣量最大，與前人研究規(guī)律一致，說明添加適量比例葡萄籽能促進(jìn)底物被微生物利用，但當(dāng)葡萄籽添加比例為20% 以上后產(chǎn)氣量有一定程度的下降，說明添加過高比例的葡萄籽后，導(dǎo)致日糧中中性洗滌纖維與酸性洗滌纖維水平增加，改變了日糧的精粗比結(jié)構(gòu)，從而影響了產(chǎn)氣量[19]。葡萄籽中含有豐富的原花青素，利用鐵鹽催化比色法測定葡萄籽中原花青素含量為80～232 mg/g[20]。Rira 等[21]用3 種富含單寧的植物分別以25%、50% 和75% 的比例與干草混合，24 h體外產(chǎn)氣量均降低，也可能是葡萄籽中單寧影響了瘤胃發(fā)酵模式。

表3 添加不同比例的葡萄籽體外發(fā)酵48 h 各時(shí)間點(diǎn)的干物質(zhì)降解率 %

表4 添加不同比例的葡萄籽體外發(fā)酵48 h 各時(shí)間點(diǎn)的粗蛋白質(zhì)降解率 %

表5 尼龍袋體外發(fā)酵8～48 h 的NH3-N 濃度 mg/100mL

表6 體外產(chǎn)氣48h 發(fā)酵液中的pH、NH3-N 和MCP 濃度

圖1 尼龍袋體外發(fā)酵48 h 各時(shí)間點(diǎn)的pH

3.2 葡萄籽添加比例對瘤胃干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)降解率的影響 飼料在瘤胃的降解主要是瘤胃微生物和微生物分泌酶作用的結(jié)果，飼料在瘤胃中的降解率是衡量飼料營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)。張力莉等[16]研究發(fā)現(xiàn)在體外試驗(yàn)中添加葡萄渣干物質(zhì)消化率降低。本試驗(yàn)中隨著葡萄籽添加比例的增加，飼料樣品的干物質(zhì)降解率下降。干物質(zhì)降解率下降可能是因?yàn)槠咸炎阎行韵礈炖w維和酸性洗滌纖維含量較高（40%以上），添加葡萄籽使飼料中粗纖維含量升高，而纖維性飼料作為反芻動(dòng)物飼料本就存在消化率低的特點(diǎn)[22]。

李會(huì)菊等[23]研究發(fā)現(xiàn)在綿羊日糧中添加16% 和24%的葡萄籽均顯著降低粗蛋白質(zhì)表觀消化率；高新梅等[24]以瘤胃尼龍袋法測得TMR 日糧中添加4%以上的葡萄渣可以顯著降低蛋白質(zhì)有效降解率。Bruno-Soares等[25]在羽扇豆中添加不同量的葡萄籽提取單寧，蛋白質(zhì)瘤胃降解率顯著降低。楊凱[26]的研究結(jié)果表明，添加6.5、13.0、26.0 g/kg 單寧酸分別使蛋白質(zhì)消化率降低5.0%、8.6%和15.7%。本試驗(yàn)添加16%以上的葡萄籽顯著降低蛋白質(zhì)有效降解率，與前人研究規(guī)律一致，可能是葡萄籽中含有豐富單寧降低了蛋白質(zhì)降解率。單寧在植物中通常與植物蛋白質(zhì)通過氫鍵結(jié)合為較穩(wěn)定的單寧蛋白質(zhì)化合物，使得蛋白質(zhì)在瘤胃中的吸收受阻。尚凱寧等[27]研究表明，小麥蛋白中添加高粱單寧，小麥蛋白的體外消化率降低，電鏡下可以觀察到高粱單寧與小麥蛋白質(zhì)絡(luò)合形成難以被消化酶水解的絡(luò)合物。

3.3 葡萄籽添加比例對瘤胃內(nèi)環(huán)境的影響 微生物的種類決定瘤胃的發(fā)酵模式，瘤胃微生物的活性受pH 影響。瘤胃正常的pH 為5.50～7.00[28]，本試驗(yàn)中pH 在正常的發(fā)酵范圍內(nèi)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，pH 隨綿羊全價(jià)日糧中添加葡萄籽的比例增高而升高，但張雪峰等[17]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加葡萄籽對瘤胃pH 無顯著影響，但也有研究發(fā)現(xiàn)添加不同劑量葡萄籽精油提高發(fā)酵液的pH[15]。瘤胃氮代謝過程中外源蛋白質(zhì)和內(nèi)源含氮物質(zhì)降解產(chǎn)生NH3-N。NH3-N 濃度可以反映飼料的降解和吸收程度。大量研究證明，瘤胃內(nèi)NH3-N 的適宜濃度為6.3～27.5 mg/100mL[29]。菌體蛋白（MCP）是反芻動(dòng)物重要的蛋白質(zhì)氮源，NH3-N 也是瘤胃微生物合成（菌體蛋白）的原料，NH3-N 和菌體蛋白濃度具有較高的相關(guān)性，因此可以NH3-N 濃度推測瘤胃微生物合成作用的強(qiáng)弱[30]。Abarghuei 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中加入葡萄渣會(huì)降低瘤胃液發(fā)酵液NH3-N 濃度；趙棟等[32]以連續(xù)動(dòng)態(tài)人工瘤胃試驗(yàn)得出結(jié)果，添加14%～16%的葡萄渣顯著降低瘤胃液NH3-N 濃度；劉潔等[20]試驗(yàn)中精粗比的降低也引起瘤胃了NH3-N 濃度的下降。本試驗(yàn)體外發(fā)酵48 h隨著葡萄籽添加比例的增加發(fā)酵液中的NH3-N 濃度雖有波動(dòng)但總體呈下降趨勢，與前人研究結(jié)果一致，說明添加過高比例葡萄籽使瘤胃pH 升高、NH3-N 濃度降低，瘤胃細(xì)菌數(shù)量減少，間接地降低了瘤胃微生物利用NH3-N 合成瘤胃微生物蛋白的速率，最終降低了瘤胃MCP 產(chǎn)量。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，全價(jià)日糧中添加8%～16% 的葡萄籽可以提高飼料的產(chǎn)氣量，添加16% 以上的葡萄籽粗蛋白質(zhì)有效降解率顯著降低，瘤胃pH 升高，干物質(zhì)降解率降低。從體外產(chǎn)氣試驗(yàn)和體外發(fā)酵試驗(yàn)來看，綿羊日糧中葡萄籽的適宜添加比例為8%～12%。