劉靈曄，李 娟，曹 蓓，楊元勛，錢 薇

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院I期臨床試驗研究室，南京 210008

鹽酸左氧氟沙星片屬于喹諾酮類抗菌藥，為氧氟沙星的左旋體，其抗菌活性約為氧氟沙星的兩倍[1]，它的主要作用機(jī)制為抑制細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶（細(xì)菌拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ）的活性，阻礙細(xì)菌DNA復(fù)制。左氧氟沙星具有抗菌譜廣、抗菌作用強(qiáng)的特點，適用于敏感病原菌所致泌尿道感染、前列腺炎、淋病、呼吸道感染以及革蘭陰性桿菌所致各種感染及骨、關(guān)節(jié)、軟組織的感染。

食物可能通過影響胃腸道的生理功能，從而改變藥物的生物利用度，影響參比制劑和受試制劑的生物等效性。通常情況下，高熱量、高脂肪食物更容易導(dǎo)致藥物的生物利用度發(fā)生較大的改變。藥物臨床試驗中常采用預(yù)期最大影響胃腸道生理功能的高脂食物，使藥物受到的影響最大化，從而考察最敏感飲食條件下兩制劑生物等效性的差異。根據(jù)《以藥動學(xué)參數(shù)為終點評價指標(biāo)的化學(xué)藥物仿制藥人體生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，本研究以鹽酸左氧氟沙星片（樂朗?）為受試制劑，以左氧氟沙星片為參比制劑，分別考察在空腹以及進(jìn)食高脂餐條件下的生物等效性評價，為臨床用藥的有效性和安全性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

受試制劑：鹽酸左氧氟沙星片（該藥于2015年國內(nèi)批準(zhǔn)上市，每片500 mg，批號：170925JN，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)）；參比制劑：左氧氟沙星片（商品名：可樂必妥?，每片500 mg，批號：BS064G1，第一三共制藥（北京）有限公司生產(chǎn)）；左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品（純度97.3%，中國食品藥品檢定研究院）；內(nèi)標(biāo)左氧氟沙星-d8（含量95.05%，Toronto Research Chemicals）。

乙睛、甲醇為色譜純（Merck KGaA）；醋酸銨和甲酸為分析純（Sigma-Aldrich）；水為去離子水。

1.2 儀器

島津高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（包括LC-30AD液相泵、CTO-20AC柱溫箱、SIL-30ACMP自動進(jìn)樣器和AB Sciex TQ5500質(zhì)譜儀）。Sartorius BP211D型電子天平（梅特勒-托利多公司）。

1.3 研究對象

空腹試驗：24名健康志愿受試者，其中男性18名，女性6名，年齡平均（26.4±6.6）歲。餐后試驗：24名健康志愿受試者，其中男性21名，女性3名，年齡平均（26.5±6.1）歲。所有受試者體質(zhì)量指數(shù)（BMI）均在18～28 kg·m-2范圍內(nèi)。

受試者完全知情并簽署知情同意書后，進(jìn)行包括問診（藥物過敏史、既往病史、毒品史、吸煙史、飲酒史、獻(xiàn)血史、用藥史等）、人口資料學(xué)及生命體征、體格檢查、12導(dǎo)聯(lián)心電圖、胸片、實驗室檢測（血生化、血常規(guī)、尿常規(guī)、凝血功能、傳染病四項檢查、女性血清/尿妊娠）、藥物篩查、酒精呼吸測試等。當(dāng)受試者各項檢查結(jié)果均符合試驗方案要求后方可入選。

1.4 試驗設(shè)計

本研究采用單中心、開放、隨機(jī)、單劑量、兩周期、兩序列、交叉試驗設(shè)計。將空腹組和餐后組的受試者隨機(jī)分為兩組，在空腹或進(jìn)食高脂高熱量早餐（總熱量800～1000千卡，其中約50%的熱量來自于脂肪）后，分別服用受試制劑或參比制劑500 mg，用240 mL溫開水送服。服藥前及服藥后1 h內(nèi)禁止飲水，給藥后4 h內(nèi)禁食，4 h后進(jìn)食統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)餐。空腹試驗于給藥0 h（給藥前2 h內(nèi)）以及給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3.5、6、8、12、24、36、48 h分別取靜脈血4 mL；餐后試驗于給藥0 h（給藥前2 h內(nèi)）以及給藥后0.5、1、1.5、2、2.25、2.5、2.75、3、3.5、4.5、6、8、12、24、36、48 h分別取靜脈血4 mL（肝素抗凝）。兩組均在2～8 ℃、離心力為2000 g條件下離心10 min，分離血漿，于-70 ℃冰箱中保存待測。1周后兩組受試者交叉重復(fù)上述試驗。

1.5 血藥濃度測定方法

1.5.1 色譜條件 色譜柱：Poroshell 120 SB-C18（50 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動相：含10 mmol·L-1醋酸銨和0.5%甲酸的水溶液-乙腈；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃。

1.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子化，正離子模式檢測，離子化電壓為2500V，溫度為650℃，檢測離子對質(zhì)荷比為362.1/261.1和370.3/326.2，駐留時間為280ms。

1.5.3 血漿樣品處理 精密吸取離心后的血漿50 μL，加入30 μL內(nèi)標(biāo)左氧氟沙星-d8溶液（0.5 μg·mL-1），振蕩混勻，加入300 μL純甲醇，渦旋10 min，4000r·min-1離心10min，取上清液50μL，加入400μL流動相溶液稀釋進(jìn)樣。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用Phoenix WinNonlin 6.4統(tǒng)計軟件處理血藥濃度數(shù)據(jù)，并計算參數(shù)。AUC0-t用梯形法計算；t1/2用藥-時曲線末端相計算（0.693 t1/2/λz）；tmax、Cmax用實測數(shù)值。相對生物利用度用AUC0-t（受試制劑）/AUC0-t（參比制劑）×100%估算。對AUC0-t、AUC0-∞、Cmax對數(shù)轉(zhuǎn)換值進(jìn)行方差分析和雙單側(cè)t檢驗及90%置信區(qū)間估計。tmax進(jìn)行非參數(shù)檢驗（秩和檢驗），對兩種制劑作出生物等效性評價。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 倫理審查

本研究嚴(yán)格遵守《赫爾辛基宣言》人體醫(yī)學(xué)研究的倫理準(zhǔn)則、CFDA頒布的《藥物臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范》、ICH/GCP以及國內(nèi)法律法規(guī)的相應(yīng)要求，并通過南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員審查。

2.2 方法學(xué)評價

本試驗建立了人血漿中左氧氟沙星的HPLCMS/MS測定方法，選擇性良好，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品的測定；以左氧氟沙星峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值f對血藥濃度C作回歸計算，得回歸方程f=0.286 1×C+0.000 165 3，r2=0.999 6,權(quán)重系數(shù)w=1/C2，在0.100～10.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，高、中、低三個濃度（7.50、3.00、0.250 μg·mL-1）的質(zhì)控樣品批內(nèi)、批間精密度均不大于5.7%。左氧氟沙星血漿樣品在室溫、長期凍存及反復(fù)凍融條件下穩(wěn)定性良好。

2.3 藥-時曲線

24名健康受試者空腹單次口服受試制劑與參比制劑500 mg后，平均血藥濃度-時間曲線見圖1。該曲線表明，空腹試驗受試制劑與參比制劑血藥濃度隨時間變化趨勢相近。

24名健康受試者餐后單次口服受試制劑與參比制劑500 mg后，平均血藥濃度-時間曲線見圖2。該曲線表明，餐后試驗受試制劑與參比制劑血藥濃度隨時間變化趨勢相近。

2.4 藥動學(xué)參數(shù)

以測得的左氧氟沙星血藥濃度-時間數(shù)據(jù)，計算主要藥動學(xué)參數(shù)。健康受試者單次口服受試制劑與參比制劑后的主要藥動學(xué)參數(shù)見表1。

表1 健康受試者口服受試制劑與參比制劑后的主要藥動學(xué)參數(shù)（）

表1 健康受試者口服受試制劑與參比制劑后的主要藥動學(xué)參數(shù)（）

2.5 生物等效性評價

兩制劑的AUC0～48h、AUC0-∞、Cmax經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后，進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示，制劑間、周期間和個體間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；經(jīng)雙單側(cè)t檢驗和90%置信區(qū)間分析，受試制劑的lnAUC0～48h、lnAUC0-∞和lnCmax均在參比制劑80%～125%范圍內(nèi)（表2），tmax進(jìn)行非參數(shù)檢驗顯示，制劑間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明兩種制劑具有生物等效性。

表2 雙單側(cè)t檢驗結(jié)果

2.6 安全性評價

在空腹試驗研究中，24例受試者兩周期間共有9例受試者發(fā)生10例次不良事件，其發(fā)生率為37.5%（9/24），其中與藥物“很可能有關(guān)”4例次，“可能有關(guān)”1例次，“可能無關(guān)”5例次。發(fā)生的不良反應(yīng)主要有丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高2例次、便尿膽原升高1例次、血膽紅素升高1例次、貧血1例次。

在餐后試驗研究中，24例受試者兩周期間共有16例發(fā)生20例次不良事件，其發(fā)生率為66.67%（16/24）。其中與藥物“很可能有關(guān)”3例次，與藥物“可能有關(guān)”6例次，與藥物“可能無關(guān)”11例次。發(fā)生的不良反應(yīng)主要是尿中帶血4例次、血尿2例次。

3 討論

生物等效性試驗是將仿制藥的藥學(xué)一致（質(zhì)量）和治療一致（有效和安全）與原研產(chǎn)品建立連接的關(guān)鍵[2]。在仿制生產(chǎn)已有國家標(biāo)準(zhǔn)藥品時，可通過生物等效性研究來證明仿制產(chǎn)品與原研藥是否具有生物等效性，是否可與原研藥替換使用。左氧氟沙星由賽諾菲-安萬特公司開發(fā)，商品名為“Tavanic”，國內(nèi)無進(jìn)口制劑、有進(jìn)口本地化制劑上市，該劑為第一三共制藥（北京）有限公司生產(chǎn)。該公司在亞洲的生產(chǎn)和銷售權(quán)為原研公司賽諾菲授予，因此其左氧氟沙星片即是原研制劑，根據(jù)國家參比制劑遴選原則以及CFDA發(fā)布的仿制藥參比制劑目錄，可作為國內(nèi)一致性評價的參比制劑。本研究考察了已上市鹽酸左氧氟沙星片與左氧氟沙星片的相對生物利用度和生物等效性，表明江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)的鹽酸左氧氟沙星片與其參比制劑左氧氟沙星片具有治療一致性，可為其臨床用藥的有效性和安全性提供參考。

目前在國內(nèi)外針對鹽酸左氧氟沙星的分析方法主要為高效液相色譜聯(lián)合紫外檢測器法[3-5]，而本研究采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS），具有更高的靈敏度、更好的選擇性等優(yōu)點。本方法采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的左氧氟沙星（左氧氟沙星-d8）作為內(nèi)標(biāo)，其與待測物左氧氟沙星有相似的理化性質(zhì)，兩者保留行為和離子化行為基本一致，可以避免基質(zhì)效應(yīng)、回收率等導(dǎo)致檢測結(jié)果不可靠的情況出現(xiàn)。

通過對主要藥動學(xué)參數(shù)比較，餐后組的tmax比空腹組的略長，AUC0～48h略低，但無統(tǒng)計學(xué)意義，主要藥動學(xué)參數(shù)與文獻(xiàn)報道一致[6-8]。

本研究入選的受試者全部納入安全性評價，所有不良事件結(jié)果均為受試者痊愈或恢復(fù)至基線水平。試驗中發(fā)生的不良事件與該藥品說明書及既往研究報道的不良事件接近[9，10]，且無嚴(yán)重不良事件發(fā)生、無因不良事件而退出試驗的受試者。綜上，本研究中所有受試者服用受試制劑與參比制劑后安全性和耐受性良好。