李洪彬，趙興奎，王 靜

1菏澤市中醫(yī)醫(yī)院 制劑科，山東菏澤 274035；2 菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東菏澤 274000

金藍(lán)清瘟合劑為我院院內(nèi)制劑，全方由板藍(lán)根、連翹、廣藿香、防風(fēng)、黃芪等14味中藥材組成，臨床上主要用于口腔、手足皰疹、發(fā)熱等手足口病輕型屬濕瘟邪毒、襲肺犯脾證的治療，效果顯著。中藥復(fù)方制劑由多味藥材按照中醫(yī)理論配伍而成，所含成分復(fù)雜，具有多組分、多靶點(diǎn)等特點(diǎn)，通過多種成分間的協(xié)同作用，從而達(dá)到臨床治療效果。金藍(lán)清瘟合劑現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)尚未對(duì)方中所含藥味進(jìn)行定量控制研究，也僅檢索到對(duì)其所含單一成分綠原酸的文獻(xiàn)報(bào)道[1]，為全面評(píng)價(jià)金藍(lán)清瘟合劑的質(zhì)量，現(xiàn)以連翹苷為內(nèi)參物，建立高效液相色譜一測(cè)多評(píng)法對(duì)合劑中8種成分進(jìn)行質(zhì)量控制，從而達(dá)成質(zhì)量穩(wěn)定性和臨床療效的一致性。

1 儀器、藥品與試劑

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Sartorius BP211D電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 藥品與試劑

對(duì)照品：連翹酯苷B（批號(hào)111811-201603，純度96.6%）、（R，S）-告依春（批號(hào)111753-201706，純度100.0%）、連翹酯苷A（批號(hào)111810-201707，純度97.2%）、連翹苷（批號(hào)110821-201816，純度95.1%）均購于中國食品藥品檢定研究院；廣藿香酮（批號(hào)PRF8072523，純度99.0%）購于成都普瑞法科技公司；牛蒡子苷元（批號(hào)16081335，純度99.1%）、新西蘭牡荊苷（批號(hào)16011122，純度99.8%）均購于上海同田生物技術(shù)股份有限公司；藿香黃酮醇（批號(hào)CFS201801，純度98.0%）購于武漢天植生物技術(shù)公司。金藍(lán)清瘟合劑（規(guī)格：每瓶裝100 mL，批號(hào)：20180919、20190222、20190529）為本院制劑。乙腈為色譜純，其余試劑為分析純；水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品貯備液和混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱?。≧，S）-告依春、連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷、牛蒡子苷元、新西蘭牡荊苷、藿香黃酮醇、廣藿香酮對(duì)照品各適量，用甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.268、0.532、1.914、0.718、0.186、0.348、0.162、0.244 mg·mL-1的8種對(duì)照品貯備液；精密吸取8種對(duì)照品貯備液各2.5 mL，用甲醇稀釋至50 mL，制成混合對(duì)照品溶液，含（R，S）-告依春13.4 μg·mL-1、連翹酯苷B 26.6 μg·mL-1、連翹酯苷A 95.7 μg·mL-1、連翹苷35.9 μg·mL-1、牛蒡子苷元9.3 μg·mL-1、新西蘭牡荊苷17.4μg·mL-1、藿香黃酮醇8.1μg·mL-1、廣藿香酮12.2 μg·mL-1。

2.2 供試品溶液和陰性樣品溶液的制備

精密吸取金藍(lán)清瘟合劑3.0 mL，用甲醇稀釋至25 mL，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，制成其供試品溶液；按照本合劑的處方量分別稱取不含板藍(lán)根、連翹、廣藿香的陰性樣品，再按以上供試品溶液制備方法分別制成陰性樣品溶液。

2.3 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱：Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～11.0 min，12.0%A；11.0～15.0 min，12.0%A→20.0%A；15.0～27.0 min，20.0%A→38.0%A；27.0～42.0 min，38.0%A→45.0%A；42.0～50.0 min，45%A→12.0%A）；檢測(cè)波長分別為245 nm[2，3][0～15.0 min檢測(cè)（R，S）-告依春]、275 nm[3，4]（15.0～27.0 min檢測(cè)連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷、牛蒡子苷元）和309 nm[5，6]（27.0～50.0 min檢測(cè)新西蘭牡荊苷、藿香黃酮醇、廣藿香酮）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。

精密吸取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液及“2.2”項(xiàng)下各溶液適量，依法進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，合劑中（R，S）-告依春、連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷、牛蒡子苷元、新西蘭牡荊苷、藿香黃酮醇、廣藿香酮的色譜峰與相鄰色譜峰均能有效分離，分離度均>1.5，理論塔板數(shù)按各成分色譜峰計(jì)均≥4500，陰性樣品對(duì)合劑中8種成分的測(cè)定無干擾。見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.1”項(xiàng)下8種對(duì)照品貯備液各0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別用甲醇稀釋定容至20 mL，制成6個(gè)線性關(guān)系考察用系列混合對(duì)照品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)（R，S）-告依春、連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷、牛蒡子苷元、新西蘭牡荊苷、藿香黃酮醇、廣藿香酮的峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，各成分質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。上述8種成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄（R，S）-告依春、連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷、牛蒡子苷元、新西蘭牡荊苷、藿香黃酮醇、廣藿香酮的色譜峰峰面積，各成分峰面積的RSD分別為1.03%、0.97%、0.55%、0.71%、1.24%、1.16%、1.30%、1.19%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次金藍(lán)清瘟合劑樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，依法進(jìn)樣檢測(cè)（R，S）-告依春、連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷、牛蒡子苷元、新西蘭牡荊苷、藿香黃酮醇、廣藿香酮的色譜峰峰面積，計(jì)算得8種成分含量的RSD分別為1.39%、1.25%、1.08%、1.47%、0.76%、1.59%、0.87%、1.62%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取金藍(lán)清瘟合劑樣品的同一份供試品溶液，于0、2、4、6、10、18、24 h進(jìn)樣檢測(cè)（R，S）-告依春、連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷、牛蒡子苷元、新西蘭牡荊苷、藿香黃酮醇、廣藿香酮的色譜峰峰面積，結(jié)果本合劑供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定，8種成分峰面積的RSD分別為1.04%、0.95%、0.58%、0.73%、1.19%、1.14%、1.32%、1.22%。

表1 8種成分的回歸方程和線性范圍

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知成分含量的同批供試品9份，每份精密量取1.5 mL，隨機(jī)分成3組（高、中、低濃度），再精密加入一定量的被測(cè)成分對(duì)照品。中濃度加入量與所取供試品中待測(cè)成分量之比為1∶1，高、低濃度分別為1.5∶1、0.5∶1。

按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，用實(shí)測(cè)值與供試品中含有量之差，除以加入對(duì)照品量計(jì)算回收率。結(jié)果所測(cè)成分（R，S）-告依春、連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷、牛蒡子苷元、新西蘭牡荊苷、藿香黃酮醇、廣藿香酮的平均加樣回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為98.77%（1.06%）；99.96%（0.74%）；100.00%（0.61%）；99.21%（0.82%）；96.98%（1.27%）；97.95%（1.33%）；98.00%（1.52%）；97.74%（1.11%）。

2.9 相對(duì)校正因子的測(cè)定

精密吸取“2.4”項(xiàng)下6個(gè)線性關(guān)系考察用系列混合對(duì)照品溶液適量，依法進(jìn)樣測(cè)定（R，S）-告依春、連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷、牛蒡子苷元、新西蘭牡荊苷、藿香黃酮醇、廣藿香酮的峰面積，以連翹苷為內(nèi)參物，按 照計(jì)算公式：fk/s=fk/ fs=（YkXs）/（YsXk）（式中Y代表峰面積，X代表質(zhì)量濃度，k代表內(nèi)參物連翹苷，s代表其他7種待測(cè)成分）分別計(jì)算各種成分的相對(duì)校正因子。見表2。

表2 以連翹苷為內(nèi)參物各成分的相對(duì)校正因子

2.10 相對(duì)校正因子耐用性考察

2.1 0.1不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響精密吸取“2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液適量，分別在Agilent 1260型、LC-20A型高效液相色譜儀和Waters Symmetry C18、Diamonsil C18、Hypersil C18三 種色譜柱條件下，分別依法進(jìn)樣檢測(cè)（R，S）-告依春、連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷、牛蒡子苷元、新西蘭牡荊苷、藿香黃酮醇、廣藿香酮的峰面積，計(jì)算各成分的相對(duì)校正因子。見表3。

表3 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.1 0.2不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響 精密吸取“2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液適量，分別在不同柱溫（28℃、29℃、30℃、31℃、32℃）條件下，依法進(jìn)樣檢測(cè)（R，S）-告依春、連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷、牛蒡子苷元、新西蘭牡荊苷、藿香黃酮醇、廣藿香酮的峰面積，檢測(cè)不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響。見表4。

表4 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.1 0.3不同體積流量對(duì)相對(duì)校正因子的影響 精密吸取“2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液適量，分別在不同體積流量（0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL·min-1）條件下，依法進(jìn)樣檢測(cè)（R，S）-告依春、連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷、牛蒡子苷元、新西蘭牡荊苷、藿香黃酮醇、廣藿香酮的峰面積，檢測(cè)不同體積流量對(duì)相對(duì)校正因子的影響。見表5。

表5 不同體積流量對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.11 待測(cè)組分色譜峰的定位

精密吸取“2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液適量，分別在Agilent 1260型、LC-20A型高效液相色譜儀和Waters Symmetry C18、Diamonsil C18、Hypersil C18三種色譜柱條件下，分別依法進(jìn)樣檢測(cè)，記錄（R，S）-告依春、連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷、牛蒡子苷元、新西蘭牡荊苷、藿香黃酮醇、廣藿香酮的色譜峰的保留時(shí)間，以內(nèi)參物連翹苷色譜峰為基準(zhǔn)峰，采用相對(duì)保留時(shí)間值法對(duì)各成分色譜峰進(jìn)行定位。見表6。

表6 各種成分的相對(duì)保留時(shí)間值

2.12 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較

取3個(gè)批次的金藍(lán)清瘟合劑樣品適量，按“2.2”項(xiàng)下方法每個(gè)批次平行制備3份供試品溶液，依法進(jìn)樣檢測(cè)（R，S）-告依春、連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷、牛蒡子苷元、新西蘭牡荊苷、藿香黃酮醇、廣藿香酮的峰面積，采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法分別計(jì)算（R，S）-告依春等8種成分的含量并作比較。見表7。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇

金藍(lán)清瘟合劑由14味藥材組方而成，方中連翹、金銀花辛涼透邪清熱、芳香辟穢解毒，合為君藥。廣藿香芳香化濁、發(fā)表解暑、和中止嘔，茵陳、滑石粉清熱利濕、解毒療瘡，防風(fēng)祛風(fēng)解表，葛根解肌退熱，蘆根清熱瀉火，白芷解表散寒、消腫排膿，合為臣藥。板藍(lán)根、拳參解毒利咽、涼血止痛，炒白術(shù)、黃芪升陽利濕、健脾益氣，合為佐藥。甘草調(diào)和諸藥，為使藥。參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物以君臣佐使的確認(rèn)原則，本合劑選取方中君藥連翹所含主要成分連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷和牛蒡子苷元；臣藥廣藿香所含主要成分藿香黃酮醇和廣藿香酮；佐藥板藍(lán)根所含主要成分（R，S）-告依春為定量指標(biāo)成分，以期為全面評(píng)價(jià)該合劑整體質(zhì)量提供參考依據(jù)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)選取乙腈-水[3]、甲醇-水[7]、乙腈-0.2%磷酸水溶液[2，4，5]和乙腈-0.2%甲酸水溶液[6]4個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行對(duì)比考察，以合劑中待測(cè)8個(gè)目標(biāo)成分的分離效果為主要指標(biāo)，同時(shí)兼顧色譜圖基線、分析檢測(cè)時(shí)間以及雜質(zhì)峰干擾等因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈-0.2%磷酸水溶液系統(tǒng)基線平穩(wěn)且與待測(cè)8種成分分離效果較好。先以等度洗脫難以實(shí)現(xiàn)對(duì)8種成分的有效分離，故而采用梯度洗脫法對(duì)流動(dòng)相中水相和有機(jī)相的比例不斷摸索優(yōu)化，最終采用乙腈-0.2%磷酸水溶液為流動(dòng)相，對(duì)金藍(lán)清瘟合劑中8種成分同時(shí)進(jìn)行測(cè)定。

表7 兩種測(cè)定法各成分含量測(cè)定結(jié)果比較（n=3，mg·mL-1）