徐佳雯，李 尚，張彥卓，胡雅君，張 斐*

1 徐州醫(yī)科大學(xué) 新藥研究與臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，徐州221000 2 江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，徐州 221000

小兒癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE）屬于常見(jiàn)急性病的一種，臨床上常使用地西泮、咪達(dá)唑侖、丙戊酸鈉靜脈注射方式治療[1]，起效快，但作用持續(xù)時(shí)間短，且需要醫(yī)務(wù)人員操作。而直腸用凝膠可用于急性發(fā)作時(shí)的病情控制，操作方便起效快，適合家庭使用。

地西泮直腸凝膠由瓦利安特（Valeant）制藥國(guó)際公司研發(fā)并于2005年上市，作為治療癲癇的一種新劑型，它是美國(guó)FDA迄今唯一批準(zhǔn)可居家安全使用的癲癇急性發(fā)作的治療藥。國(guó)內(nèi)未有同品種上市。

地西泮直腸凝膠在制備和存儲(chǔ)過(guò)程中會(huì)受到微生物的污染，為保證產(chǎn)品的穩(wěn)定性和安全性，處方中添加了輔料苯甲酸鈉、苯甲酸和苯甲醇作為防腐劑。由于苯甲酸及其鹽類攝入過(guò)量會(huì)影響人體對(duì)鈣的吸收、刺激胃腸道系統(tǒng)，并有一定致癌性和細(xì)胞毒性[2]，需控制其含量；而苯甲醇易被氧化，毒性強(qiáng)，在兒童用藥方面受到限制[3]。ICH Q6a中明確規(guī)定制劑標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)制定防腐劑含量的可接受標(biāo)準(zhǔn)[4]。因此，防腐劑含量的測(cè)定是藥品質(zhì)量控制中的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

《中國(guó)藥典》2015版、歐洲藥典、英國(guó)藥典、日本藥典等[5-9]對(duì)地西泮注射液和地西泮片中的地西泮含量測(cè)定采用高效液相色譜法，方法重現(xiàn)性差，峰形不佳，且無(wú)法同時(shí)測(cè)定苯甲酸和苯甲醇含量。目前尚無(wú)同時(shí)測(cè)定這3個(gè)組分的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本文采用高效液相色譜法（HPLC），同時(shí)測(cè)定地西泮直腸凝膠中地西泮、苯甲酸、苯甲醇的含量，方法簡(jiǎn)便、高效、靈敏度高，為該制劑中主藥及防腐劑含量的控制提供依據(jù)。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Agilent 1260 infinityⅡ高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；ME55型、ME204E型電子天平，F(xiàn)E28型pH計(jì)（均梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2 藥品與試劑

地西泮原藥（批號(hào)：161101，山東信宜制藥有限公司）；苯甲酸（批號(hào)：20180802-202007，四川樂(lè)康藥用輔料有限公司）；苯甲酸鈉（批號(hào)：20180425-20200424，湖北華日制藥有限公司）；苯甲醇（批號(hào)：20181001-2020.09，成都華邑藥用輔料制造有限責(zé)任公司）；無(wú)水乙醇（藥用級(jí)，批號(hào)：P1464903，南京化學(xué)試劑股份有限公司）；丙二醇（批 號(hào)100420181101，湖南爾康制藥股份有限公司）；羥丙基纖維素E5（批號(hào)：PD229197，上?？?lè)康包衣技術(shù)有限公司）；乙酸銨（色譜純）；冰醋酸（分析純）；甲醇（色譜純）；水為純凈水。

2 方 法

2.1 地西泮直腸凝膠的制備

精密稱定地西泮原藥50 mg，置于100 mL燒杯內(nèi)，依次加入苯甲酸鈉4.0 g、苯甲酸0.2 g、苯甲醇1.5 g、乙醇10.0 g、丙二醇40.0 g和羧甲基纖維素E5 100 g，攪拌均勻，加水至100.0 g，再次混合均勻后，即得地西泮直腸凝膠樣品，密封靜置備用。

按本方法共制備3批，批號(hào)分別為：N19040201、N19040202、N19040203。

2.2 測(cè)定方法

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相A：0.05 mol·L-1乙酸銨緩沖溶液（稱取乙酸銨3.8 g，加水溶解并稀釋至1000 mL，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至4.0），流動(dòng)相B：甲醇，按表1進(jìn)行梯度洗脫；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 地西泮對(duì)照品溶液配制 精密稱定地西泮原藥50 mg，置于25 mL量瓶中，加稀釋劑（乙酸銨緩沖溶液/甲醇=65∶35）溶解稀釋至刻度，搖勻，作為地西泮對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密吸取該儲(chǔ)備液2.5 mL至50 mL量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，制成含地西泮0.1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.2.3 苯甲酸對(duì)照品溶液配制 精密稱定苯甲酸359 mg，置于25 mL量瓶中，加稀釋劑溶解并定容至刻度，搖勻，作為苯甲酸對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密吸取該儲(chǔ)備液2.5 mL至50 mL量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，制成含苯甲酸718 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.2.4 苯甲醇對(duì)照品溶液配制 精密稱定苯甲醇對(duì)照品300 mg，置于50 mL量瓶中，加稀釋劑溶解并定容至刻度，搖勻，作為苯甲醇對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密吸取該儲(chǔ)備液2.5 mL至50 mL量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，制成含苯甲醇0.3 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.2.5 混合對(duì)照品溶液配制 分別精密吸取地西泮對(duì)照品儲(chǔ)備液、苯甲醇對(duì)照品儲(chǔ)備液、苯甲酸對(duì)照品儲(chǔ)備液各1.0 mL，置于20 mL量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即為混合對(duì)照品溶液。

2.2.6 供試品溶液配制 精密稱定地西泮直腸凝膠樣品（批號(hào)為19040201）1.0 g至50 mL量瓶中，加稀釋劑溶解并定容至刻度，搖勻，即為供試品溶液。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適用性及專屬性考察

分別精密量取地西泮對(duì)照品溶液、苯甲酸對(duì)照品溶液、苯甲醇對(duì)照品溶液、混合對(duì)照品溶液、稀釋劑各10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣。

結(jié)果表明，地西泮、苯甲酸和苯甲醇的分離度均大于1.5，達(dá)到基線分離。理論塔板數(shù)均大于15 000。見(jiàn)圖1。

3.2 線性關(guān)系考察

精密量取地西泮對(duì)照品溶液、苯甲酸對(duì)照品溶液、苯甲醇對(duì)照品溶液各0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mL，分別置于50 mL量瓶中，加稀釋劑稀釋成一系列不同濃度的對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL。以峰面積（Y），濃度（X，μg·mL-1）進(jìn)行線性回歸，得地西泮、苯甲酸和苯甲醇回歸方程與線性范圍，見(jiàn)表2。結(jié)果表明，地西泮、苯甲酸和苯甲醇線性關(guān)系均良好，r2均≥0.999 8。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

3.3 定量限設(shè)定

取“2.2.5”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣測(cè)定，按峰高為噪音10倍測(cè)得量為定量限。結(jié)果表明地西泮、苯甲酸、苯甲醇的定量限分別為0.10、0.18、1.00 μg·mL-1。

3.4 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

精密吸取同一混合對(duì)照品溶液10μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，測(cè)得地西泮、苯甲酸、苯甲醇峰面積的RSD分別為0.02%、0.03%、0.04%（n=6）。表明精密度均良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取“2.2.6”項(xiàng)下的供試品溶液10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、1、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，測(cè)得地西泮、苯甲酸、苯甲醇峰面積的RSD分別為0.11%、0.32%、0.19%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一批地西泮直腸凝膠樣品（批號(hào)N19040201），按“2.2.6”項(xiàng)下制備方法平行制備供試品溶液6份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定，分別記錄每份供試品溶液中地西泮、苯甲酸、苯甲醇的峰面積，地西泮、苯甲酸、苯甲醇的平均含量的RSD分別為1.92%、1.50%、1.37%。表明該方法重復(fù)性良好。

3.7 加樣回收率試驗(yàn)

稱取同一批已知含量的地西泮直腸凝膠（批號(hào)N19040201）9份，每份1.0 g，分別置于25 mL量瓶中，精密量取地西泮、苯甲酸、苯甲醇對(duì)照品溶液3.5、2.5、1.5 mL各3份，加入上述量瓶?jī)?nèi)（加入水平依次為80%、100%、120%），加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取上述溶液5 mL，分別置于20 mL量瓶中，加稀釋劑溶解并定容至刻度，搖勻，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算3種成分的含量及回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。地西泮、苯甲酸和苯甲醇的平均回收率均在98%～101%，RSD均小于2.0%（n=9）。表明該方法回收率符合要求。

3.8 耐用性檢測(cè)

取同一批供試品溶液（批號(hào)N19040201），分別在pH值3.8、4.0、4.2，流速0.8、1.0、1.2 mL·min-1，柱溫30 ℃、35 ℃、40 ℃條件下進(jìn)樣，記錄峰面積，并考察各成分峰之間的分離情況，結(jié)果見(jiàn)表4。地西泮、苯甲酸、苯甲醇的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于15 000，各成分含量測(cè)定值的RSD值均在限定范圍內(nèi)（≤2.00%），本方法耐用性良好。

3.9 樣品測(cè)定

精密稱定不同批號(hào)樣品2.0 g，各2份，按“2.2.6”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以外標(biāo)一點(diǎn)法分別計(jì)算地西泮、苯甲酸、苯甲醇的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

表4 耐用性考察因素及實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=2）

4 討論

4.1 流動(dòng)相pH值的選擇

本實(shí)驗(yàn)選擇乙酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相和稀釋劑，其pH值是4.0，苯甲酸鈉在此條件下可完全轉(zhuǎn)化成苯甲酸。

表5 3批地西泮直腸凝膠中地西泮、苯甲酸、苯甲醇含量檢測(cè)結(jié)果（n=2）

4.2 流動(dòng)相比例的選擇

苯甲酸和苯甲醇需要在高比例水相下出峰，地西泮需要在高比例有機(jī)相下出峰，本方法結(jié)合3種成分的出峰位置和峰形，選用梯度洗脫程序。本法選用的梯度洗脫程序可同時(shí)用于地西泮直腸凝膠有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)，在地西泮峰和苯甲酸峰相隔時(shí)間內(nèi)可檢測(cè)到其他雜質(zhì)峰。如果只用于含量檢測(cè)，可通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化，縮短檢測(cè)時(shí)間。

本實(shí)驗(yàn)可在同一色譜條件下，同時(shí)測(cè)定地西泮直腸凝膠中地西泮、苯甲酸、苯甲醇的含量，方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，為有效控制地西泮等成分的含量提供了科學(xué)依據(jù)。