黃攀，張琳蕾，易興陽(yáng)*，韓釗*

(1.德陽(yáng)市人民醫(yī)院，四川 德陽(yáng)；2. 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，浙江 溫州)

0 引言

缺血性卒中是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的重大疾病，發(fā)病率高，占所有腦卒中的80%左右，溶栓治療和神經(jīng)保護(hù)治療是其兩大主要治療策略。然而，迄今尚無(wú)有效的神經(jīng)保護(hù)劑獲得臨床指南推薦[1,2]，但是人類(lèi)研發(fā)有效神經(jīng)保護(hù)劑的探索一直沒(méi)有終止。1-三氟甲氧基苯基-3(1-丙酰哌啶-4-基)脲[1-trifluoromethoxyphenyl-3-(1 -propionyl-piperidin-4-yl)urea，TPPU] 是2012 年由加利福尼亞大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院分子生物科學(xué)中心Bruce 教授等合成的一種新型sEH 抑制劑[3]，在多種動(dòng)物模型中顯示其在抗炎和心、腎保護(hù)方面均優(yōu)于傳統(tǒng)sEH 抑制劑[4]。心臟動(dòng)物模型研究也表明[5]，TPPU可預(yù)防心肌梗死后心肌纖維化，具有抗凋亡、抗氧化、保護(hù)線粒體等多種功能。但TPPU 在腦缺血后神經(jīng)保護(hù)作用研究少，TPPU 是否具有腦保護(hù)作用。因此本試驗(yàn)主要探討TPPU 對(duì)缺血性大鼠水通道蛋白(AQP4)及神經(jīng)功能的影響。

1 研究方法

1.1 pMCAO 模型的制備

選取250-300g 左右的成年雄性SD 大鼠，采用Longa 線栓法制作。參照本研究小組以往的方法，水合氯醛(350mg/kg，腹腔注射)麻醉后，手術(shù)顯微鏡下分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，充分游離ECA 主干，電凝其遠(yuǎn)端并切斷，在殘端剪一小口。采用0.26mm 尼龍魚(yú)線頭端去棱角鈍化處理作為線栓，將制備好的尼龍栓線插入ICA 顱內(nèi)段，當(dāng)遇到輕微阻力時(shí)停止，結(jié)扎ECA 根部絲線。尼龍絲線插入深度為19-22mm，造成大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，讓線栓持續(xù)阻塞，不拔出線栓，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。假手術(shù)組線栓插入深度為10mm，栓線頭端停留于ICA 內(nèi)。術(shù)后將動(dòng)物置于放有清潔墊料的飼養(yǎng)盒，自由飲水、進(jìn)食。在這些操作過(guò)程中，體溫保持在(37±0.5)°C。局部腦血流量(rCBF) 可借助軟質(zhì)探針和激光多普勒血流測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)量。此模型制備操作簡(jiǎn)便、副損傷小、梗死灶部位恒定，可以滿足研究的要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組(每組12 只)

設(shè)空白對(duì)照組、pMCAO 模型組(pMCAO+DMSO)、pMCAO 模型+TPPU 給藥組。pMCAO 模型+TPPU 給藥組按照TPPU 濃度劑量分為為0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg 共4 個(gè)亞組。

1.3 干預(yù)方法

空白對(duì)照組、假手術(shù)組和MCAO 模型組均由腹腔注射相應(yīng)劑量生理鹽水，pMCAO 模型+ TPPU 給藥組造模后即刻由腹腔注射相應(yīng)濃度劑量的TPPU 干預(yù)。各組在造模后2h，進(jìn)行Longa 法神經(jīng)功能缺損評(píng)分，判斷模型成功與否。0 分：正常，無(wú)神經(jīng)損傷征象；1 分：動(dòng)物不能完全伸展右前肢；2 分：動(dòng)物右側(cè)肢體癱瘓，行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，出現(xiàn)追尾現(xiàn)象；3 分：行走時(shí)向右側(cè)跌倒，或動(dòng)物不能站立或動(dòng)物打滾；4 分：無(wú)自發(fā)活動(dòng)，有意識(shí)障礙。神經(jīng)功能缺損評(píng)分1-3 分為造模成功，0 分和4 分為造模不成功予以剔除，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)充剔除的動(dòng)物，保證每組動(dòng)物數(shù)量。

1.4 觀測(cè)指標(biāo)

pMCAO 后24h 測(cè)定下列指標(biāo)并進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)比較分析：

1.4.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

造模后2h、24h(處死動(dòng)物前)采用Longa 法進(jìn)行評(píng)分。

1.4.2 采用干濕質(zhì)量法

腦缺血24h 后處死大鼠，快速斷頭取腦，濾紙擦去表面水分，取缺血側(cè)半邊大腦，置天平內(nèi)精密稱(chēng)取濕質(zhì)量，然后置110℃電烤箱24h，再迅速測(cè)干質(zhì)量。計(jì)算腦含水量用濕重的百分比表示為：( 濕重- 干重)/ 濕重×100%。采用Western-blot 法檢測(cè)AQP4 蛋白的表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用T 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

造模后2h、24h(處死動(dòng)物前)采用Longa 法進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Pmcao+DMSO 組比較，pMCAO+0.5mg/kg 組、pMCAO+2.0mg/kg 組 差 異 無(wú) 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義(P＞0.05)，而pMCAO+1.0mg/kg 組、pMCAO+1.5mg/kg 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 各組腦組織AQP4 蛋白比較

與 Pmcao+DMSO 組 比 較，pMCAO+1.5mg/kg 組、pMCAO+2.0mg/kg 組 差 異 無(wú) 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義(P＞0.05)，而pMCAO+0.5mg/kg 組、pMCAO+1.0mg/kg 組 差 異 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意義(P＜0.05)。

3 討論

圖1 各組mNSS 評(píng)分比較

花生四烯酸(arachidonic acid，AA) 是人體內(nèi)心腦血管活性物質(zhì)的前體，其代謝產(chǎn)物與腦血管病的發(fā)病密切相關(guān)[5]。AA的細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP) 代謝通路是近年研究的熱點(diǎn)[6]。AA 在CYP 羥化酶作用下生成羥基二十碳四烯 酸(hydroxyeicosatetraenoic acid，HETEs)，在CYP 表 氧 化酶作用下生成環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acid，EETs)，EETs 再經(jīng)過(guò)可溶性環(huán)氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase，sEH) 作用下生成生物活性較弱的二羥基二十碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acid，DHETs)。HETEs 具有強(qiáng)力的腦血管收縮作用和促動(dòng)脈粥樣硬化作用。而EETs 具有擴(kuò)血管、調(diào)節(jié)離子通道、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種生物學(xué)功能，對(duì)心腦血管具有保護(hù)作用。我們近期臨床研究發(fā)現(xiàn)，AA 的CYP 代謝通路代謝產(chǎn)物(EETs 和HETEs) 水平與急性缺血性卒中后神經(jīng)功能惡化密切相關(guān)[7,8]，提示它們?cè)谀X缺血性損傷中可能發(fā)揮重要作用。

血腦屏障(BBB) 的破壞是缺血性卒中的重要病理機(jī)制。星型膠質(zhì)細(xì)胞參與對(duì)BBB 完整性的維持障礙。AQP4 主要分布于星型膠質(zhì)細(xì)胞足突，是介導(dǎo)水進(jìn)入腦組織的最主要蛋白。腦缺血損傷后，AQP4 表達(dá)升高，水通道開(kāi)放，大量水分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)形成細(xì)胞內(nèi)水腫，引起血腦屏障破壞。c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38 MAPK 信號(hào)通路參與對(duì)水通道蛋白4 的調(diào)控。近年研究表明，細(xì)胞凋亡在腦缺血中可能起主導(dǎo)作用，腦缺血損傷后缺血半暗帶產(chǎn)生的主要病理生理機(jī)制之一是細(xì)胞凋亡，線粒體結(jié)構(gòu)和功能改變?cè)诩?xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用[9]。腦缺血后NCU 和BBB 損傷的線粒體細(xì)胞凋亡信號(hào)通路是目前關(guān)注的熱點(diǎn)。

本研究結(jié)果表明，不同劑量的TPPU 對(duì)缺血性腦卒中神經(jīng)血管單元具有保護(hù)作用，調(diào)控水通道蛋白的表達(dá)進(jìn)而影響血腦屏障進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)血管單元是其可能機(jī)制之一。

圖2 各組AQP4 蛋白比較