楊清源，朱國平,4*

(1. 上海海洋大學 海洋科學學院，上海 201306；2. 上海海洋大學 極地研究中心，上海 201306；3. 大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點實驗室 極地海洋生態(tài)系統(tǒng)研究室，上海 201306；4. 國家遠洋漁業(yè)工程技術研究中心，上海 201306)

1 引言

南美洲南部大陸架水域共有14種南美南極魚[1]，其中位于巴塔哥尼亞海域的拉氏南美南極魚（Patagonotothen ramsayi）數(shù)量最為豐富[2]。盡管拉氏南美南極魚具有重要的生物學意義，但對于其生物學的研究仍不夠深入。Ekau[2]發(fā)現(xiàn)這一物種明顯表現(xiàn)出性別的二態(tài)性，雄性的臀鰭、腹鰭和身體前部呈深黑色，而雌性則呈棕色至綠色。該文還指出，拉氏南美南極魚產卵發(fā)生在南半球秋季的阿根廷陸架以及春季的布爾德伍德淺灘。Sosiński和Janusz[3]也證實了兩個區(qū)域產卵時間的差異。Brickle等[4]對拉氏南美南極魚的年齡與生長進行了研究，發(fā)現(xiàn)它是一種生長速度相對較慢的魚類，最大年齡可達14齡。另外，Hart[5]還提供了一些關于其攝食及捕食者的信息。因拉氏南美南極魚存在晝夜垂直移動的特性[6]，所以它不僅可以捕食一些膠狀及甲殼類的浮游生物，還會捕食部分底棲生物[2,7]。近期研究還發(fā)現(xiàn)，拉氏南美南極魚偶爾也會捕食一些漁業(yè)丟棄物，尤其是魷魚[8-9]。與此同時，拉氏南美南極魚也是許多大型魚類的攝食對象[7]，甚至被巴布亞企鵝（Pygoscelis papua）所捕食[10]。該過程對于巴塔哥尼亞海域能量由海表至海底間的傳遞有著重要作用。因此，開展拉氏南美南極魚攝食生態(tài)學的研究可為了解由低營養(yǎng)級至高營養(yǎng)級之間的能量流動以及有機質由上層至中下層的垂直運輸過程提供依據(jù)。

使用傳統(tǒng)的胃含物分析法可以知曉拉氏南美南極魚的主要攝食對象、攝食的時空差異[6-7,9,11]。但該方法只能反映短期的攝食情況，對于食物同化情況以及長期的攝食趨勢不能夠反映。為了解決這個問題，已有學者提出利用肌肉組織中穩(wěn)定同位素及脂類（尤其是脂肪酸和脂肪醇）作為食性指標[12-15]。對于脂類來說，食物中的脂肪酸組成會影響肝臟、性腺、肌肉等組織的脂質成分[16]。dos Santos等[17]曾分析不同攝食條件下鱈魚不同組織內脂肪酸組成情況，Beckmann等[18]則分析了不同喂養(yǎng)條件下，鯊魚肝臟和肌肉組織中脂肪酸分布情況。因此，若利用脂肪酸作為生物標志物探究拉氏南美南極魚的攝食生態(tài)學，需要了解各組織中脂肪酸的分布情況。目前，關于拉氏南美南極魚脂肪酸組成的研究僅見于肌肉組織，且僅對其營養(yǎng)價值進行了評估[19]，尚未有人將其脂肪酸組成應用于攝食生態(tài)學研究。鑒于此，本研究旨在：（1）描述拉氏南美南極魚3種組織中脂肪酸分布情況，（2）分析3種組織中的脂肪酸是否能表征其攝食情況，以及（3）研究拉氏南美南極魚的食性及其能量轉移情況。

2 方法

2.1 樣品收集

拉氏南美南極魚樣本由中國水產有限公司“龍騰”號于西南大西洋水域進行中層拖網(wǎng)作業(yè)時所收集，采樣深度范圍為20～160 m（即阿根廷巴塔哥尼亞大陸架），取樣時間為2014年12月至2015年4月，取樣站點如圖1所示。所有海上隨機采集的樣本立即放入-20℃冷凍條件下保存，運回國內實驗室后放入-80℃的超低溫冰箱內保存，以便進行脂類分析。

2.2 方法

2.2.1 脂肪酸提取及測定

圖1 調查區(qū)域與站點Fig. 1 The study area with showing the sample locations

在實驗室中，將樣本解凍后首先測定其體長和體質量等，其中體長測量使用精度為1 mm的鋼尺，體質量測定使用精度為1 g的電子秤；測量完基礎生物學后，取樣本背鰭附近肌肉、肝臟及性腺部分，用超純水沖洗干凈后裝入離心管，然后放入冷凍干燥機（Christ Alpha 1-4），在-55°C 下冷凍干燥 24 h，所有樣品使用混合型球磨儀（Retsch - MM440）粉碎，裝入離心管待測。根據(jù)Folch法進行粗酯的提取[20]。依據(jù)GB/T 17376—2008《動植物油脂脂肪酸甲酯制備》三氟化硼法進行脂肪酸甲酯化。以37種脂肪酸混標及內標十九烷酸甲酯標品作為標準，利用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（Agilent，GC-MS 7890B）進行測試。

2.2.2 指標的測定與計算

以37種脂肪酸混標及內標十九烷酸甲酯標品作為標準，通過比對保留時間對脂肪酸進行定性分析，采用內標法對脂肪酸進行定量分析。脂肪酸含量使用以下內標法公式得出其質量分數(shù)，并用單位干質量的拉氏南美南極魚肌肉組織中每種脂肪酸的含量（單位：mg/g）表示，即

式中，Xi為待測樣品中組分i的含量，單位為mg/g；ms為待測樣品中加入內標物的質量，單位為mg；Ai為組分i的峰面積，無單位；fs,i為組分i與內標物的校正因子之比，稱為相對校正因子，無單位；m為樣品的質量，單位為g；As為待測樣品中內標物的峰面積，無單位。

2.2.3 指示食性的特征脂肪酸

特征脂肪酸可以指示生物食性，結合已有研究（表1），分析不同組織中脂肪酸組成與食性關系。

2.3 數(shù)據(jù)處理

首先利用Shapiro-Wilk檢驗分析脂肪酸含量數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，若不符合，則將數(shù)據(jù)轉換成對數(shù)形式后再進行檢驗，以使得數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。利用配對t檢驗分析兩兩脂肪酸含量或類型之間是否存在顯著性差異（顯著性水平設為0.05）。使用主成分分析（Principal Components Analysis，PCA）以研究 3 種組織間脂肪酸特征的變化，并鑒定對這種變異影響最大的脂肪酸類型。所有平均值均以平均值±標準差表示。PCA及統(tǒng)計分析均采用R程序（R Core Team 2017）處理。

表1 在拉氏南美南極魚體內發(fā)現(xiàn)的主要脂肪酸及直接與間接食物源Table 1 The main fatty acids found in the rock cod and their corresponding potential food sources

3 結果

3.1 拉氏南美南極魚生物學信息

拉氏南美南極魚體長范圍為111.0～288.0 mm，平均體長為（209.7±40.9）mm；體質量范圍為 20.8～451.3 g，平均體質量為（177.12±115.90）g。據(jù) Sosiński和Janusz[3]的研究，拉氏南美南極魚于體長為240 mm時達到性成熟。據(jù)此，本研究將樣品體長分為2組：100 mm≤L＜240 mm屬小體長組，240 mm≤L歸大體長組（表2）。

表2 拉氏南美南極魚體長分組Table 2 The size group of the rock cod

3.2 3種組織中脂肪酸組成

由西南大西洋拉氏南美南極魚3種組織中共檢測出27種脂肪酸，飽和脂肪酸（Saturated Fatty Acid，SFA）包括10種，單不飽和脂肪酸（Monounsaturated Fatty Acid, MUFA）和多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acid, PUFA）分別含7種和10種（表3）。對于3個組織而言，肌肉組織中脂肪酸含量最低為（95.39±29.14）mg/g，顯著低于肝臟（（423.89±287.16）mg/g）和性腺（（372.48±302.71）mg/g）組織（配對t檢驗：肌肉組織與肝臟組織，t=-6.99，p＜0.001；肌肉組織與性腺組織，t=-5.62，p＜0.01）。對于 SFA，肝臟組織與性腺組織中含量均較高，顯著高于肌肉組織（肝臟組織與肌肉組織，t=-8.14，p＜0.001；性腺組織與肌肉組織，t=-5.77，p＜0.001）。對于 MUFA，肝臟組織中含量最高，顯著高于性腺組織和肌肉組織（肝臟組織與性腺組織，t=3.54，p＜0.001；肝臟組織與肌肉組織，t=6.63，p＜0.001）。就PUFA而言，性腺組織中含量最高，顯著高于肝臟和肌肉組織（性腺組織與肝臟組織，t=2.56，p＜0.05；性腺組織與肌肉組織，t=4.99，p＜0.001）。對于n-3 MUFA，性腺組織中含量最高，肝臟組織次之，且均顯著高于肌肉組織（性腺組織與肌肉組織，t=-3.24，p=0.001＜0.05；肝臟組織與肌肉組織，t=-2.47，p=0.009＜0.05）；而在 n-6 PUFA 中，同樣的性腺組織含量最高，肝臟組織次之，且性腺組織含量顯著高于肝臟組織；另外，兩者含量均顯著高于肌肉組織（性腺組織與肝臟組織，t=-3.66，p＜0.001；性腺組織與肌肉組織，t=-4.78，p＜0.001；肝臟組織與肌肉組織，t=-6.35，p＜0.001）。

在C20:5n3與C22:6n3中，性腺組織中含量最高，肝臟組織次之，均顯著高于肌肉組織（C20:5n3∶性腺組織與肌肉組織，t=-3.07，p=0.002＜0.05；肝臟組織與肌肉組織，t=-3.00，p=0.003＜0.05；C22:6n3:性腺組織與肌肉組織，t=-2.03，p=0.025＜0.05；肝臟組織與肌肉組織，t=-1.84，p=0.037＜0.05）。對于 C20:4n6 來說，性腺組織中含量最高，肝臟組織次之，且性腺組織顯著高于肝臟組織，兩者均顯著高于肌肉組織（性腺組織與肌肉組織，t=-4.96，p＜0.001；肝臟組織與肌肉組織，t=-6.10，p＜0.001；性腺組織與肝臟組織，t=-3.87，p＜0.001）。

3.3 脂肪酸組成主成分分析

對拉氏南美南極魚3個組織脂肪酸組成進行主成分分析后發(fā)現(xiàn)，主成分1和主成分2分別解釋了3個組織脂肪酸組成總變異的71.61%和11.25%（圖2）。由因子載荷圖可以看出，主成分1維度負向上有C15:0+C17:0、C20:1+C22:1、C18:2n6以及 C20:4n6；主成分2維度正向上有C14:0、C16:0、C16:1n7和C18:1n9；負向上有C20:5n3及C22:6n3。

由因子得分圖可知，3個組織之間表現(xiàn)出明顯的差異。肝臟組織主要分布在主成分1正向及主成分2的正向上，該組織中C14:0、C16:0、C16:1n7和C18:1n9這4種脂肪酸對其影響較大；而性腺組織主要分布于主成分1的負向上，C15:0+C17:0、C18:2n6、C20:4n6及C20:1+C22:1對其脂肪酸組成的貢獻較大；肌肉組織主要分布于主成分1的負向和主成分2的負向上，除與性腺組織的脂肪酸具有同源脂肪酸外，C20:5n3和C22:6n3對其的貢獻也較大。

表3 拉氏南美南極魚不同組織中脂肪酸含量Table 3 Fatty acid contents in different tissues of the rock cod

圖2 拉氏南美南極魚不同組織脂肪酸含量主成分分析Fig. 2 Principal component analysis plot in different tissues of the rock cod

3.4 體長與特征脂肪酸含量的關系

表4顯示了拉氏南美南極魚3種組織脂肪酸含量與體長之間的相關性。由表4可見，肌肉組織的特征脂肪酸中，有3種脂肪酸含量與體長之間存在著明顯的線性關系，分別為C15:0+C17:0、C16:0及C20:1+C22:1，且隨著體長的增加而增加；就肝臟組織而言，有3種特征脂肪酸含量與體長之間存在著顯著的線性關系，分別為 C15:0+C17:0、C18:2n6、C20:4n6，隨著體長的增加而降低。性腺組織中，有4種特征脂肪酸與體長之間存在顯著的線性關系，分別為C15:0+C17:0、C18:2n6、C20:1+C22:1以及 C20:4n6，同樣隨著體長的增加而降低。

4 討論

4.1 3種組織對脂肪酸的吸收與分配

魚類在其不同生活史階段可能會轉變食性，且隨著魚類的生長，身體各組織部位對脂肪酸的吸收以及利用均有所不同。在魚類未達性成熟之前，魚類由外界食物來源獲取的能量（脂肪酸）用于其身體及各組織的生長；而當魚類達到性成熟之后，性腺部位獲取的脂肪酸在繁殖階段則更多地用于繁殖。基于Ekau[2]的研究，本研究中的拉氏南美南極魚樣本均未達到性成熟。因此，本文中僅由3種組織的能量分配用于生長這個角度進行分析。

表4 拉氏南美南極魚體長與特征脂肪酸含量之間的關系Table 4 The relationship between standard length and percentage of specific fatty acids in the different tissues of rock cod

脂肪酸是魚體的重要組成成分。有研究表明，肝臟是脂肪合成與轉化的主要場所，肝臟中有豐富的脂肪積累，可為性腺、肌肉等組織的發(fā)育提供能量[27-29]。拉氏南美南極魚3種組織中，肝臟中總脂肪酸含量為（423.89±287.16）mg/g，遠高于性腺中的（372.48±302.71）mg/g 及肌肉的（95.39±29.14）mg/g。由此可見，拉氏南美南極魚更傾向于在肝臟中存儲及合成脂類，之后通過血液、淋巴系統(tǒng)等將脂肪酸轉移到其他組織[21]。此外，肝臟中SFA和MUFA含量均為3個組織中最高，而PUFA含量卻相對較低，這可能由于食物中的PUFA被優(yōu)先輸送到性腺和肌肉等組織中，以供應生長和發(fā)育的需求。類似的結果在貝類中也得到證實[22]，這種差異的存在也因各組織具有的不同生理功能所致。性腺的PUFA含量顯著高于肝臟和肌肉，這是因為PUFA在卵巢中選擇性地積累規(guī)律所致，豐富的PUFA可以為卵子和胚胎的發(fā)育提供相應的營養(yǎng)，如形成細胞膜結構、調節(jié)細胞膜的離子通道和促進發(fā)育等[30]；其中n-3 PUFA和n-6 PUFA最為重要，特別是 C22:6n3（DHA）、C20:5n3（EPA）和C20:4n6（ARA）。DHA和EPA是海水魚類不能完全依靠自身合成以滿足其生長發(fā)育所需的長鏈不飽和脂肪酸，必須由食物中獲取，ARA在某些海水魚類的正常發(fā)育中也起著重要作用[31]。由本文結果來看，拉氏南美南極魚3個組織中DHA、EPA和ARA的含量均以性腺最高，肝臟次之，肌肉最低。這表明拉氏南美南極魚性腺組織在生長過程中選擇性地儲存這些脂肪酸。由于本研究所使用的樣本體長多低于27.5 cm，未達到性成熟體長[2,32]。所以，可推測現(xiàn)階段對于脂肪酸的積累為后期性腺發(fā)育儲備了條件，如ARA可以提升精子的生存能力[33]，DHA和EPA可保障幼體的視覺系統(tǒng)發(fā)育等[34-35]。

4.2 哪種組織脂肪酸組成最適合用于指征食性？

Jeffries[36]發(fā)現(xiàn)，某一海區(qū)生態(tài)系統(tǒng)中脂肪酸組成特征由該海區(qū)存在的浮游植物所決定，而每一個門類的浮游植物均由其特征脂肪酸指示。于此，本研究總結了拉氏南美南極魚體內脂肪酸潛在的食物來源（表 1）。

對于肝臟組織來說，在兩個體長組的樣品中，C14:0、C16:0、C16:1n7及C18:1n9這4種脂肪酸含量均較高，而PUFA并未體現(xiàn)出明顯特征，這與肝臟本身的功能有關，其通常儲存大量的SFA和MUFA，而PUFA優(yōu)先供給其他組織。此結果似乎暗示拉氏南美南極魚可能會大量攝食硅藻、甲藻以及褐藻等，然而對比已有研究[2,7,9]可知，其胃含物中并未發(fā)現(xiàn)這些藻類的存在。另外，C15:0+C17:0、C18:2n6、C20:4n6的含量隨體長增加而降低，暗示隨著拉氏南美南極魚的生長，其對于浮游細菌、海藻的攝食減少，且底棲攝食特性減弱。而基于已有胃含物分析[2]發(fā)現(xiàn)，相對于小體長，大體長魚類的攝食范圍較廣，且更多地攝食底棲魚類。Rossi等[37]曾指出，DHA/EPA的比值越高，其指征的營養(yǎng)級越高，在兩個體長組中比值分別為0.59±0.20及0.47±0.11，說明大體長拉氏南美南極魚呈現(xiàn)出較低的營養(yǎng)級水平。此外，本研究水域處于西南大西洋重要的魷魚漁場。已有多項研究顯示，拉氏南美南極魚胃中發(fā)現(xiàn)了漁業(yè)丟棄物的存在，如魷魚和各種經濟魚種等[2,7-9]。綜合這些證據(jù)可知，該海域的拉氏南美南極魚應處于一個較高的營養(yǎng)級水平。據(jù)此，以肝臟組織中脂肪酸組成指示其食性會存在一定的誤差。

在兩個體長組樣品的性腺組織中，C15:0+C17:0、C18:2n6、C20:1+C22:1及C20:4n6的貢獻率均較大，表現(xiàn)出大量攝食浮游細菌、陸源有機質以及浮游動物的情況，同時也表現(xiàn)出底棲性攝食特征。考慮到本研究的樣本基本未達性成熟，性腺內儲存的脂肪酸大部分用于正常生長。但性腺組織中DHA與EPA含量較低，且小體長組中DHA/EPA為0.62±0.20，大體長組中為0.46±0.15，對于食性的指征體現(xiàn)出大體長的拉氏南美南極魚營養(yǎng)級低于小體長魚類，這與胃含物分析結果存在偏差。考慮到處于未成熟階段的個體性腺組織還未發(fā)育，對于DHA和EPA并未進行選擇性儲存。此外，性腺組織在不同的發(fā)育階段對于不同類型脂肪酸的需求程度有異[16]。因此，利用性腺組織對其食性進行指征也會出現(xiàn)一定的差異。

綜上分析，肝臟和性腺組織呈現(xiàn)的結果稍顯偏差，這與各組織對于脂肪酸的儲存及使用情況有關。對于拉氏南美南極魚來說，肌肉組織更新時間長，能夠反映較長時間，甚至一生對食物中脂肪酸的吸收情況。

4.3 拉氏南美南極魚在生長過程中如何轉換食性？

通過胃含物分析發(fā)現(xiàn)，拉氏南美南極魚整個生活史過程中存在著食性的轉換[2,6-7,9]。在肌肉組織中，DHA與EPA的貢獻率較高，且小、大體長組DHA/EPA值分別為0.35±0.16和0.36±0.13，說明大體長的拉氏南美南極魚體現(xiàn)出稍高的營養(yǎng)級[37]。此外，Budge和Parrish[38]指出，在捕食者中只有植食性橈足類能夠通過其特有的途徑將C18:1和C20:1通過碳鏈延長大量合成C20:1和C22:1。因此，C20:1和C22:1可作為橈足類攝食其他浮游植物的指示。Falk-Petersen等[26]提出，這兩種脂肪酸也可以作為高營養(yǎng)級捕食者攝食植食性橈足類的指示。在本研究中，大體長拉氏南美南極魚體內C20:1+C22:1含量高于小體長魚類，且隨著體長的增加，其含量呈顯著性增加趨勢。由此推測，隨著拉氏南美南極魚的生長，其攝食以植食性橈足類為食的生物的程度有所增加。就C18:2n6來說，曾有研究提出其為一種典型的陸源脂肪酸[25]，其在肌肉組織脂肪酸中貢獻率較大。這表明，拉氏南美南極魚在巴塔哥尼亞陸架區(qū)對于陸源有機物或以其為食物的生物有一定的攝食。考慮到拉氏南美南極魚在近岸和大洋水域均有分布，而本研究區(qū)域位于陸架區(qū)。因此，這種陸源有機物可能由東?？颂m流由福克蘭群島或阿根廷漂流由阿根廷近岸攜帶至本研究海區(qū)[34]，也有可能是本研究區(qū)域的拉氏南美南極魚在近岸水域攝食，然后洄游至陸架區(qū)所致[39]。此外，大體長拉氏南美南極魚體內C18:2n6含量高于小體長魚類，說明大體長魚類洄游能力高于小體長魚類，攝食范圍也隨著增加。飽和脂肪酸中，C15:0和C17:0可用來指示食物中細菌的貢獻[22]，肌肉組織中C15:0+C17:0也表現(xiàn)出明顯的特征，其大體長拉氏南美南極魚體內含量較高，由此推測拉氏南美南極魚在攝食浮游生物過程中可能順帶攝入浮游細菌?？偟膩碇v，肌肉組織脂肪酸表現(xiàn)出的特征表明拉氏南美南極魚呈現(xiàn)出浮游生物食性[40]。另一方面，肌肉組織中C20:4n6含量較高，貢獻率較大，是能夠指征底棲生物食性的脂肪酸[26]。由此可見，拉氏南美南極魚能夠較易地在浮游及底棲生活之間轉換。該結果與Kock[41]的分析一致。這也是為什么拉氏南美南極魚肌肉中δ15N和δ13C含量與體長之間無線性關系存在的原因[39]。針對PUFA，主要由n-3系列和n-6系列脂肪酸組成，其中n-3系列脂肪酸可以指示浮游植物通過捕食食物鏈向更高營養(yǎng)級捕食者傳遞[42]，而n-6系列脂肪酸中，C20:4n6所占比重最高。所以，n-6 PUFA/n-3 PUFA的比值被用來估計腐生食物鏈和捕食食物鏈對于高營養(yǎng)級捕食者的貢獻程度[42]。在拉氏南美南極魚體內，n-6 PUFA/n-3 PUFA的比值與體長之間并無明顯的線性關系。這可能是因為大、小個體拉氏南美南極魚胃含物中均發(fā)現(xiàn)了漁業(yè)丟棄物，從而導致腐生食物鏈和捕食食物鏈的貢獻率特征弱化。此外，該現(xiàn)象也可能是因為隨著生長，其在浮游與底棲環(huán)境之間頻繁轉換所致。

在本研究中，隨著拉氏南美南極魚的生長，其對于浮游細菌、浮游動物以及底棲魚類的攝食均會增加，表明其攝食特性由浮游性攝食方式轉變?yōu)楦∮?底棲性攝食，且增強對于陸源有機質的攝食，推測其洄游能力有所增強。但由于漁業(yè)丟棄物的影響，導致其營養(yǎng)級水平升高，腐生食物鏈和捕食食物鏈的貢獻率特征弱化。從這個角度來看，人類活動，尤其是漁業(yè)活動，可能會影響或干擾大洋性生態(tài)系統(tǒng)結構。

致謝：本研究所使用樣品均為中國水產有限公司所屬漁船“龍騰”號船長及全體船員協(xié)助收集，實驗過程在上海海洋大學極地研究中心和大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點實驗室完成，在此深表謝忱！