鄭雅瑩 馬挺軍

(北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)又名昆諾阿藜、南美藜等，為一年生藜科草本植物[1]。藜麥籽粒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)12.5%～16.7%，且必需氨基酸比例均衡，其中富含的組氨酸為嬰幼兒所必需的氨基酸[2]；藜麥中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為58.1%～64.2%，但其血糖生成指數(shù)較低，適于糖尿病人食用[3]；藜麥籽粒中礦物質(zhì)含量高，Ca和Fe含量高于小麥、玉米等谷物[4]。藜麥中富含具有抗衰老作用的維生素C和維生素E[5]以及不飽和脂肪酸[6]。同時(shí)，藜麥籽粒中含有黃酮、皂苷、多酚、γ-氨基丁酸以及蛻皮激素[7-10]等具有生物活性的功能成分。因此藜麥具有降血糖、抗氧化以及抗癌等生理功能[11]。因而被譽(yù)為“營(yíng)養(yǎng)黃金”[12]。

蛻皮激素是一類天然甾體化合物，既存在于昆蟲(chóng)體內(nèi)為昆蟲(chóng)換羽激素，又存在于植物中為植物次生代謝產(chǎn)物—植物蛻皮激素，保護(hù)植物免受昆蟲(chóng)和線蟲(chóng)的侵害[13]。蛻皮激素對(duì)哺乳動(dòng)物和人類具有多種藥理作用，如抗氧化、促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)的合成、促進(jìn)糖代謝和脂類代謝、預(yù)防骨質(zhì)疏松、促進(jìn)表皮細(xì)胞分化等作用[14，15]。蛻皮激素在植物中的含量遠(yuǎn)高于在動(dòng)物體內(nèi)的含量，且只有少數(shù)食用植物中存在蛻皮激素，包括菠菜、藜科以及薯蕷，其中藜麥中β-蛻皮激素含量為0.184～0.484 mg/g，是菠菜的4～12倍[16-19]。β-蛻皮激素(又稱20-羥基蛻皮激素或蛻皮甾酮，20-hydroxyecdysone)是藜麥中最主要的蛻皮激素，還有一些微量單體，如羅漢松甾酮A、24-epi-羅漢松甾酮A、24(28)-dehydro-蛻皮甾酮A等[20]，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

β-蛻皮激素的提取方法有超聲法、溶劑回流提取法和浸提法[21]。李紅舟[22]研究超聲法對(duì)露水草β-蛻皮激素的提取工藝，優(yōu)化料液比、提取液體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間以及提取溫度，得到β-蛻皮激素得率為1.9%；徐慧[23]研究藍(lán)耳草β-蛻皮激素的提取工藝，通過(guò)對(duì)比超聲提取和回流提取法，得到β-蛻皮激素得率分別為0.034%和0.041%。Graf等[24]采用浸提法提取藜麥β-蛻皮激素，在80 ℃下，用70%乙醇提取4 h，β-蛻皮激素的得率為0.031%。超聲提取法較浸提法和溶劑回流提取法具有處理時(shí)間短、提取溫度低等優(yōu)勢(shì)，且對(duì)甾體類化合物的提取效果較好，適合β-蛻皮激素的提取。

本實(shí)驗(yàn)以藜麥為原料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取β-蛻皮激素的工藝條件，利用高效液相色譜法測(cè)定β-蛻皮激素含量，同時(shí)測(cè)定其體外抗氧化活性，為藜麥蛻皮激素類物質(zhì)的進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)利用提供參考。

圖1 藜麥中主要蛻皮激素化合物的結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“冀藜1號(hào)”藜麥：河北張家口農(nóng)業(yè)科學(xué)院；β-蛻皮激素標(biāo)準(zhǔn)品、ABTS、甲醇(色譜純)、超純水、無(wú)水乙醇(分析純)、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉；維生素C 。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-700E型超聲波清洗器；常規(guī)冷凝裝置；SH B-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵；TDZ5M型臺(tái)式低速離心機(jī)；DH-101型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；德?tīng)柛咚俜鬯闄C(jī)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-2000；Shimadzu LC-20AD液相色譜。

1.3 方法

1.3.1 藜麥β-蛻皮激素的提取及其含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取藜麥粉1.0 g，按一定液料比加入乙醇溶液，30 ℃下于700 W、40 kHz下超聲，4 000 r/min離心10 min，取上清液，旋蒸至干，加入甲醇重溶，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

色譜條件：色譜柱：TC-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇：水=40：60(V/V，%)；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：246 nm；柱溫:31 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2 β-蛻皮激素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確配制0.005、0.01、0.02、0.04、0.08 mg/mL的β-蛻皮激素標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)色譜圖中峰面積計(jì)算β-蛻皮激素含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值，以色譜圖中峰面積為縱坐標(biāo)y，以待測(cè)樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示?；貧w方程為y=2×107x+9075.5(R2=0.999 7)，數(shù)據(jù)顯示曲線擬合性良好。

圖2 β-蛻皮激素標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

精確稱取藜麥粉1.0 g于50 mL離心管中，分別加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇水溶液10 mL，在30 ℃下超聲提取30 min，離心取上清液，旋蒸至干，加入甲醇5 mL重溶，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

1.3.3.2 超聲時(shí)間的選擇

精確稱取藜麥粉1.0 g于50 mL離心管中，加入60%乙醇水溶液10 mL，在30 ℃下分別超聲提取10、20、30、40、50 min，離心取上清液，旋蒸至干，加入甲醇5 mL重溶，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

1.3.3.3 液料比的選擇

精確稱取藜麥粉1.0 g于50 mL離心管中，分別按照2∶1、6∶1、10∶1、14∶1、18∶1(mg/L)的液料比加入60%乙醇水溶液，在30 ℃下超聲提取30 min，離心取上清液，旋蒸至干，加入甲醇5 mL重溶，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

1.3.4 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行三因素三水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，優(yōu)化藜麥中β-蛻皮激素含量的工藝條件。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、超聲提取時(shí)間(B)、液料比(C)作為響應(yīng)面優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，分別以-1、0、1對(duì)自變量的實(shí)驗(yàn)水平編碼，共有17組實(shí)驗(yàn)，其中12組為析因點(diǎn)；5組為區(qū)域的中心零點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平

1.3.5 藜麥β-蛻皮激素體外抗氧化實(shí)驗(yàn)—ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)

根據(jù)宋思圓[25]的方法改進(jìn)，過(guò)硫酸鉀與ABTS溶液混合，室溫避光反應(yīng)12～16 h，制備得到ABTS儲(chǔ)備液。用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)稀釋ABTS儲(chǔ)備液，直至在734 nm的吸光度為0.70±0.02。取4 mL ABTS測(cè)定液，加入40 μL樣品待測(cè)液，振蕩30 s，避光反應(yīng)30 min后測(cè)定734 nm處的吸光度值，平行測(cè)定3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)藜麥中β-蛻皮激素含量的影響

由圖3可知，藜麥中β-蛻皮激素提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)，藜麥中β-蛻皮激素的提取效果相對(duì)較好，為0.358 7 mg/g。而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)60%時(shí)，β-蛻皮激素的提取量逐漸下降。根據(jù)相似相溶原理，β-蛻皮激素為弱極性物質(zhì)，易溶于乙醇，而其結(jié)構(gòu)中含有6個(gè)羥基，能溶于水。因此得到乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，β-蛻皮激素提取量最大。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)藜麥中β-蛻皮激素含量的影響

如圖3所示，超聲時(shí)間在10～30 min內(nèi)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，β-蛻皮激素質(zhì)量濃度呈上升趨勢(shì)，達(dá)到30 min時(shí)β-蛻皮激素提取量最高，為0.324 6 mg/g。當(dāng)超聲時(shí)間大于30 min時(shí)，β-蛻皮激素提取量呈先下降后上升的趨勢(shì)。這可能是超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致β-蛻皮激素發(fā)生分子重排，使其在40 min時(shí)提取量降低；當(dāng)超聲時(shí)間延長(zhǎng)至50 min時(shí)，在超聲處理的作用下，β-蛻皮激素分子中負(fù)責(zé)分子重排的結(jié)構(gòu)單元合成β-蛻皮激素類似物，使其提取量增加，但并未超過(guò)峰值[26]。因此，超聲時(shí)間選擇30 min左右。

2.1.3 料液比對(duì)藜麥中β-蛻皮激素含量的影響

如圖3所示，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、超聲時(shí)間為30 min時(shí)，液料比在2∶1～14∶1范圍內(nèi)，β-蛻皮激素提取量呈逐漸上升的趨勢(shì)，當(dāng)液料比達(dá)到14∶1時(shí)，β-蛻皮激素含量為0.376 6 mg/g。當(dāng)液料比大于14∶1時(shí)，β-蛻皮激素提取量趨于平緩。這表明液料比繼續(xù)增大時(shí)，對(duì)β-蛻皮激素質(zhì)量濃度影響不顯著。因此，將液料比確定為14∶1。

圖3 超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比對(duì)藜麥β-蛻皮激素含量的影響

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以藜麥β-蛻皮激素質(zhì)量濃度為響應(yīng)值，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、超聲時(shí)間(B)、液料比(C)三個(gè)因素對(duì)其影響，采用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，建立藜麥β-蛻皮激素含量(Y)的回歸模型，擬合二次多項(xiàng)式方程：

Y=0.38-0.017A+0.012B+4.013×10-3C-4.975×10-3AB+0.016AC-4.075×10-3BC-0.051A2-0.048B2-0.034C2

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Y=0.38-0.017A+0.012B+0.016AC-0.051A2-0.048B2-0.034C2

表3 回歸模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

注：**差異極顯著(P<0.01)；*差異顯著(P<0.05)。

2.2.3 響應(yīng)面分析

由圖4a可知，在液料比為14∶1的條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間的交互作用較弱。當(dāng)固定乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，藜麥中β-蛻皮激素含量增大，但達(dá)到峰值后又呈下降趨勢(shì)。圖4b顯示，在超聲時(shí)間為30 min條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比交互作用顯著，在液料比較小時(shí)，β-蛻皮激素含量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，達(dá)到峰值逐漸下降。由圖4c可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，超聲時(shí)間和液料比的交互作用較弱。說(shuō)明超聲時(shí)間對(duì)β-蛻皮激素含量產(chǎn)生的影響與液料比的關(guān)系較小。

圖4 各因素交互作用對(duì)β-蛻皮激素含量影響的響應(yīng)面圖

通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件，并結(jié)合回歸模型和響應(yīng)面圖分析得出提取藜麥β-蛻皮激素最佳條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)58.25%、超聲時(shí)間31.12 min、液料比14.37∶1。在此條件下，預(yù)測(cè)藜麥中β-蛻皮激素含量為0.382 4 mg/g。綜合考慮實(shí)際情況，將工藝條件調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲時(shí)間30 min、液料比14∶1，在此條件下重復(fù)3次，測(cè)得β-蛻皮激素含量的平均值為0.379 1 mg/g，與模型預(yù)測(cè)值基本相符，證明此模型有效可靠。最終優(yōu)化的藜麥β-蛻皮激素的提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲時(shí)間30 min、料液比14∶1，得到β-蛻皮激素含量為0.379 1 mg/g。

2.3 體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

由圖5可知，當(dāng)β-蛻皮激素質(zhì)量濃度為0～5 μg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+·清除能力隨β-蛻皮激素質(zhì)量濃度的增加而提高，5 μg/mL β-蛻皮激素對(duì)ABTS+·的清除率為63.8%；當(dāng)β-蛻皮激素質(zhì)量濃度高于5 μg/mL時(shí)，其對(duì)ABTS+·的清除效果沒(méi)有顯著差異，抗氧化性強(qiáng)于VC。此外，可以得到β-蛻皮激素清除ABTS+·的IC50值為3.92 μg/mL。這可能由于β-蛻皮激素中具有多個(gè)羥基，可以與ABTS+·配對(duì)，從而使綠色的ABTS+·溶液褪色，反映其抗氧化能力[27]。Nsimba R Y等[28]采用DPPH自由基清除法和FRAP法對(duì)藜麥蛻皮激素抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，得到β-蛻皮激素清除DPPH自由基的IC50值為3.8 μg/mL以及FRAP法測(cè)得的IC50為34.5 μg/mL，可以得出β-蛻皮激素具有一定的抗氧化活性，與本研究結(jié)果一致。但β-蛻皮激素對(duì)ABTS+·的清除作用機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。

圖5 藜麥β-蛻皮激素對(duì)ABTS+·的清除作用

4 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法，以β-蛻皮激素含量為響應(yīng)值，對(duì)提取藜麥中β-蛻皮激素的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，最佳的提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲時(shí)間30 min、液料比14∶1，在此條件下藜麥β-蛻皮激素含量為0.379 1 mg/mL。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明：5 μg/mL的β-蛻皮激素對(duì)ABTS+·的清除率為63.8%，IC50值為3.92 μg/mL，說(shuō)明β-蛻皮激素具有一定的抗氧化活性。本研究獲得了一種簡(jiǎn)單的β-蛻皮激素提取工藝，可為后續(xù)開(kāi)發(fā)β-蛻皮激素相關(guān)產(chǎn)品提供參考。