宋廣磊 于 達(dá) 方玉佩

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，杭州 310018)

脂肪酸是人體的基礎(chǔ)營養(yǎng)素之一，特別是一些有重要生理功能的脂肪酸(ALA、CLA、DHA、EPA等)多含有不飽和雙鍵，添加到食品中極易發(fā)生光氧化、酶促氧化造成營養(yǎng)物質(zhì)喪失營養(yǎng)價(jià)值破壞，并產(chǎn)生醛、酮、酮酸及羥酸等有害氧化物，進(jìn)而造成人體早衰、腫瘤形成、動(dòng)脈硬化等潛在食品危害[1]。亞麻籽油富含的α-亞麻酸(α-Linolenic acid，ALA)具有抗血栓、降血脂、抗腫瘤以及促進(jìn)嬰兒大腦發(fā)育增強(qiáng)記憶力和改善視力情況等生理功能，但是亞麻籽油極易氧化、酸敗并產(chǎn)生難聞氣味，嚴(yán)重影響了亞麻籽油的營養(yǎng)價(jià)值和在食品中的應(yīng)用[2]。

關(guān)于應(yīng)用微膠囊化技術(shù)手段提高脂肪酸、營養(yǎng)因子的儲(chǔ)存特性等已有一些研究，但目前關(guān)于微膠囊體系的微結(jié)構(gòu)制備幾乎都是基于微膠囊形成的外殼組裝[3-5]，如層層自組裝微膠囊[6]、納米微膠囊[7]等，很少有考慮到用內(nèi)部相(油脂相)的微結(jié)構(gòu)制備來控制微膠囊體系，并且有的微膠囊制備過程中使用具有毒副作用的高分子如聚苯乙烯/單氟磷酸鈉、TDI與1,6-己二胺等材料，大大限制了在食品中的應(yīng)用[8]。為了解決這一問題，本研究將內(nèi)部相微結(jié)構(gòu)技術(shù)與微膠囊化技術(shù)相結(jié)合，將β-谷甾醇和γ-谷維素在植物油中混合以自組裝成納米級的管狀晶體，管狀晶體的聚集和交互作用能夠構(gòu)成空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，以固化脂肪酸。通過添加β-谷甾醇和γ-谷維素有望改善傳統(tǒng)油脂粉末的缺點(diǎn)，陰離子多糖利用靜電作用而添加到微膠囊外殼上能夠有效延緩內(nèi)容芯材的氧化，并抑制微膠囊在模擬消化條件下的消化率[9]。研究制備形成具有緩釋特性的多糖微膠囊外殼，使微膠囊具備良好的保護(hù)性、緩釋性和安全性，為食品中的功能因子和不穩(wěn)定成分的靶向輸送提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

谷維素、植物甾醇、α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰酶、糖化酶膽鹽、尿素、硫氰化鉀、氯化鈉、氯化鉀、亞麻籽油、乳清蛋白粉。

1.2 儀器與設(shè)備

JB-3型定時(shí)恒溫磁力攪拌器；YC-015噴霧干燥器；XP-201偏光顯微鏡；Delta-320 pH計(jì)；FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī)；JY-92超聲波細(xì)胞破碎儀；GZX-9240數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱； S-4700掃描電子顯微鏡；LS-230激光衍射粒度分析儀；膠體點(diǎn)位測定系統(tǒng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 火龍果果皮多糖的制備

參考Dalonso等[10]方法制備火龍果果皮粗多糖。取火龍果果皮粗多糖(100 mg)溶于2 ml超純水中，上樣于DEAE-Cellulose 52柱(1.6 cm×60 cm)中，流速為0.6 mL/min，分別用超純水、0.1 mol/L NaCl、0.2 mol/L NaCl、0.3 mol/L NaCl溶液依次洗脫，自動(dòng)部分收集器每10 min收集1管，共收集100管，苯酚-硫酸法跟蹤檢測[11]，得到洗脫曲線，合并主峰組分，超純水透析24 h除去小分子鹽，經(jīng)冷凍干燥后得到火龍果果皮多糖的DEAE-Cellulose 52分離物。所得組分分別用Sephadex G-200凝膠柱(2.6×40 cm)分離。超純水洗脫，流速0.6 mL/min，收集方法同上。獲得組分分別命名為PPP-1、PPP-2、PPP-3和PPP-4(圖1)。

1.3.2 火龍果果皮多糖微膠囊油脂粉末的制備

1.3.2.1 油相甾醇的結(jié)晶條件建立

將谷甾醇∶谷維素按照10∶0、8∶2、6∶4、4∶6、2∶8、0∶10的比例與亞麻籽油(1∶9)混合，在恒溫水浴鍋中加熱至85 ℃，保溫持續(xù)30 min后完全溶解谷甾醇和谷維素，制得油相，冷卻至室溫后將部分油脂轉(zhuǎn)移到載玻片上，在偏光顯微鏡下觀察其結(jié)晶現(xiàn)象，其余油脂置于離心管中觀察其在室溫條件下的狀態(tài)[12]。

1.3.2.2 初級乳狀液制備

初級乳液的制備曲桂芹等[13]的方法。將1%的乳清分離蛋白(WPI)溶于純水中，室溫下磁力攪拌1 h將其混合均勻制備成水相。將制備好的油相(其中谷甾醇 ∶谷維素為4∶6)與水相按質(zhì)量比1∶9的比例于85 ℃水浴下混合均勻(體系總質(zhì)量400 g)，同時(shí)加入0.5%的吐溫80作為乳化劑。利用高速混勻機(jī)于12 000 r/min下混合2 min混合3次。隨后將混勻后的乳狀液置于超聲細(xì)胞破碎儀中，在500 W功率下處理5 min使其進(jìn)一步混合均勻。最后在室溫下加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(25 U/g)作為固化劑，固化時(shí)間為2 h，最終得到初級乳狀液PE-1。對照組制備方法為油相中不加入谷甾醇和谷維素，保持其他條件不變，得到空白初級乳狀液PE-0。

1.3.2.3 二級乳狀液制備

參考李進(jìn)偉等[14]的方法，向制備好的初級乳狀液(pH=7)中加入已經(jīng)事先混合均勻的多糖溶液(PPP-3)，使制備的二級乳狀液中最終油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，WPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.45%，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%。在室溫下將乳狀液置于磁力攪拌器中攪拌30 min，然后用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)乳狀液的pH值至3.0，使多糖溶液與初級乳液通過靜電吸附作用結(jié)合，從而獲得二級乳狀液SE-1。

1.3.2.4 油脂粉末的制備

將制備好的各乳狀液用噴霧干燥器進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)樣速度：5 mL/s，氣流壓力：0.25 MPa，進(jìn)風(fēng)溫度：210 ℃，出風(fēng)溫度80 ℃，最終獲得微膠囊化亞麻油粉末油脂。噴霧干燥完成后各樣品分別命名PE-0、PE-1和SE-1。

1.3.3 微膠囊物化指標(biāo)分析

微膠囊形態(tài)特性分析參考文獻(xiàn)方法應(yīng)用掃描電子顯微鏡觀察微膠囊粉末油脂的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)[15]。微膠囊粉末油脂含水量和溶解度的分析參考Wu等[16]的方法。微膠囊粉末油脂包埋率的測定分析參考Santos等[17]的方法。微膠囊粉末油脂流動(dòng)性和粉末分層系數(shù)分析采用Rossier-Miranda等[18]的方法。

圖1 火龍果皮粗多糖在DEAE-Cellulose 52柱的洗脫曲線

1.3.4 微膠囊粉末油脂平均粒徑和Zeta電位分析

應(yīng)用Malvern MasterSizer 2000進(jìn)行懸浮液中顆粒的粒徑分布測定，并結(jié)合使用雙波長檢測系統(tǒng)來提高儀器測定過程中尺寸的性能以及其靈敏度。測量前將適量微膠囊油脂粉末樣品分散于水中，用超聲波清洗儀處理5 min使樣品均勻分散，在25 ℃條件下測量復(fù)溶后微膠囊油脂粉末形成的乳液中懸浮顆粒的粒徑和電位[19]。

1.3.5 儲(chǔ)藏過程中酸價(jià)和氧化值(POV)的變化分析

酸值是對油脂中游離脂肪酸含量進(jìn)行評價(jià)的重要指標(biāo)，游離脂肪酸是油脂敗壞的重要底物，總的來說酸值越低油脂的質(zhì)量越高。對于富含不飽和脂肪酸的亞麻籽油來說，儲(chǔ)藏時(shí)保持樣品的穩(wěn)定性是衡量微膠囊化技術(shù)成果的重要指標(biāo)。在油脂敗壞的前期，POV值的高低可以直接反映油脂氧化情況的高低。參考GB/T 5009.37—2003的分析方法對60 ℃儲(chǔ)藏21 d的酸值和氧化值(POV)進(jìn)行了分析測定。

1.3.6 體外消化特性的分析

為了測定油脂粉末在體內(nèi)的消化情況，針對所選材料和需求建立了體外消化模型。結(jié)合人體消化的過程將該體外模型分成了3個(gè)主要階段：模擬口腔液(SSF)階段、模擬胃液(SGF)階段和模擬小腸液(SIF)階段。模擬口腔階段的消化參考萬紅霞等[20]的方法。模擬胃階段的消化參考Beysseriat等[21]的方法。模擬小腸階段的消化參考曲桂芹等[13]的方法。

消化過程中粒徑的變化分析采用Yang等[22]的方法。在整個(gè)模擬消化的過程中跟蹤檢測最初的粒徑以及經(jīng)過模擬口腔和胃、模擬腸30、60、90 min以及最終消化完成后得到的粒徑，并分析其分布變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷甾醇和谷維素在油脂中的結(jié)晶現(xiàn)象

谷甾醇和谷維素在油脂中的結(jié)晶偏光顯微鏡觀察結(jié)果如圖2所示。谷甾醇濃度越高油脂冷卻后形成的結(jié)晶越大，隨著谷甾醇濃度的降低，冷卻后油脂形成的結(jié)晶越小且流動(dòng)性逐漸升高，當(dāng)谷甾醇含量為0時(shí)油脂幾乎沒有任何結(jié)晶行為，當(dāng)谷甾醇 ∶谷維素為4∶6時(shí)油脂呈現(xiàn)為良好的半固體狀態(tài)。

2.2 微膠囊粉末形態(tài)觀察

掃描電子顯微鏡結(jié)果如圖3所示。PE-0呈現(xiàn)出不規(guī)則黏連嚴(yán)重的顆粒狀，而PE-1和SE-1則呈現(xiàn)出較為規(guī)則球狀，這表明噴霧干燥前在乳化過程中加入適宜比例的谷甾醇和谷維素可明顯使噴霧干燥后的油脂顆粒變小，并且形態(tài)上呈現(xiàn)出更均勻規(guī)則的狀態(tài)。在乳化過程中加入多糖溶液可明顯使油脂微膠囊表面的微孔結(jié)構(gòu)減小，這些孔洞的形成可能與噴霧干燥水分的流失有關(guān)[23]，也有可能是因?yàn)槎嗵堑募尤朐黾恿私宦?lián)反應(yīng)使外殼的空洞結(jié)構(gòu)變小[18]。

注：a、b分別為PE-0放大2 000、5 000倍；c、d分別為PE-1放大2 000、5 000倍；e、f分別為SE-1放大2 000、5 000倍。圖3 不同樣品的掃描電子顯微鏡圖

2.3 微膠囊油脂粉末的理化指標(biāo)

復(fù)溶后的微膠囊油脂粉末理化指標(biāo)如表1所示，PE-0的含水量和分層系數(shù)要高于其他兩種油脂粉末，這可能是因?yàn)楣如薮己凸染S素的加入增加了體系的穩(wěn)定性。并且PE-0的流動(dòng)性要明顯高于PE-1和SE-0，這可能是因?yàn)镻E-0的顆粒沒有其他兩種那樣呈現(xiàn)均勻規(guī)則的狀態(tài)有關(guān)。其他各項(xiàng)指標(biāo)基本無明顯差異。

表1 復(fù)溶后微膠囊油脂粉末理化指標(biāo)

2.4 微膠囊油脂粉末粒徑和Zeta電位的結(jié)果分析

對于乳液而言，Zeta電位越高乳液就越穩(wěn)定[24]。對比PE-0和PE-1可知，甾醇和谷維素的加入可以改變微膠囊粉末的平均粒徑而不能改變其電位，結(jié)合掃描電子顯微鏡結(jié)果，推測這是因?yàn)楣如薮己凸染S素能作用于微膠囊內(nèi)部，改變微膠囊黏連不均一的狀態(tài)，從而使平均粒徑減小。由SE-1粒徑和電位的變化推測可知酸性多糖的加入成功的完成了二次包埋，即在原有基礎(chǔ)上成功在蛋白外殼上包裹了多糖改變了其帶電性使外殼變厚，使其穩(wěn)定性增強(qiáng)。表2表明在亞麻籽油微膠囊化過程中加入適宜比例的谷甾醇、谷維素和多糖能夠明顯提高其穩(wěn)定性。

表2 復(fù)溶后微膠囊油脂粉末的平均粒徑和電位

2.5 儲(chǔ)藏過程酸價(jià)和POV值的變化

油脂會(huì)因?yàn)槲⑸铩⒚?、光照或加熱而發(fā)生水解生成游離的脂肪酸，游離脂肪酸會(huì)嚴(yán)重影響油脂的質(zhì)量，酸價(jià)越低樣品越不易敗壞。由圖4a可知，起始階段3種樣品會(huì)因加工酸價(jià)而略微高于亞麻籽油自身的酸價(jià)，未包埋的亞麻籽油酸價(jià)在60 ℃儲(chǔ)藏時(shí)會(huì)由0.04 mgKOH/g快速增加到2.32 mgKOH/g，而包埋的亞麻籽油微膠囊酸價(jià)會(huì)明顯降低，SE-1的酸性多糖和蛋白外殼能有效阻隔亞麻籽油與外界環(huán)境的接觸，保護(hù)亞麻籽油使其酸價(jià)變化減弱，即酸性多糖和蛋白外殼能有效延緩亞麻籽油的氧化敗壞。

油脂氧化時(shí)過氧化物的生成速度大于游離脂肪酸的生成速度，過氧化物是油脂氧化酸敗過程的中間產(chǎn)物[25]。油脂的過氧化值是用來測定油脂中氫過氧化物含量的指標(biāo)，過氧化值越高則儲(chǔ)存過程中所生成的氫過氧化物含量越高，即過氧化值的升高意味著不飽和脂肪酸產(chǎn)品的酸敗。根據(jù)國標(biāo)規(guī)定含少量多不飽和脂肪酸含量的油脂，過氧化值不能超20 meq/kg，而對于含有較多不飽和脂肪酸的如菜籽油，過氧化值的允許上限為12 meq/kg[26]。由圖4b可知，在60 ℃儲(chǔ)藏條件下，3種樣品的過氧化值都隨著儲(chǔ)藏時(shí)間而升高，但是都要低于亞麻籽油的POV值變化，說明3種樣品都能延緩亞麻籽油的氧化速度。在21 d儲(chǔ)藏結(jié)束時(shí)PE-0的POV值達(dá)到了27.31 meq/kg，已經(jīng)超過了國標(biāo)要求，而其他2種油脂微膠囊粉末的POV值均低于國標(biāo)規(guī)定。

圖4 60 ℃儲(chǔ)藏條件下樣品酸價(jià)和POV值變化趨勢

2.6 微膠囊油脂粉末的體外模擬消化

PE-0、PE-1、SE-1在胃中消化的結(jié)果如圖5所示，由消化的最終顯微鏡觀察結(jié)果可知，PE-0經(jīng)胃消化發(fā)生了大片凝聚現(xiàn)象，PE-1雖無凝聚現(xiàn)象發(fā)生，但與SE-1相比形成的油滴更大，這可能是因?yàn)槲杆岬南筆E-0外殼結(jié)構(gòu)最先被破壞，并發(fā)生凝集，而多糖的加入可明顯延緩?fù)鈿さ南茐?，使最終出現(xiàn)的油滴減少并變小。

注：a、b、c分別為PE-0、PE-1、SE-1；1～3分別表示消化20、40、60 min。圖5 不同樣品在模擬胃中的消化情況

圖6 模擬腸道階段脂肪酸釋放率

由圖6可知不同樣品在模擬腸道階段消化速率和消化程度有明顯差異。PE-0的ALA釋放率最終為(81.2±0.8)%，明顯高于PE-1和SE-1，而PE-1高于SE-1，表明SE-1的消化率要明顯低于其他兩者。這是因?yàn)槎嗵菚?huì)在油滴表面形成界膜，會(huì)抑制脂肪酶和油脂的接觸。其次，油脂的消化過程是一種界面反應(yīng)，多糖的加入會(huì)使粒徑增加(表2)相應(yīng)的比表面積減少[27]，從而使脂肪酶與油脂接觸面積減少。此外，帶負(fù)電的多糖也可能抑制帶負(fù)電的脂肪酶與油脂接觸[28]，降低消化速率。對比3種樣品在開始階段(5 min)的釋放率可推測由于胃消化作用而有一部分油脂被釋放出來，PE-0經(jīng)胃消化脂肪釋放率最高，而多糖、甾醇和谷維素的加入可明顯延緩脂肪的釋放，這與體外模擬消化的結(jié)果相符，表明了加入了多糖、甾醇和谷維素的SE-1微膠囊油脂粉末具有耐胃消化和緩釋的作用。

模擬消化過程中粒徑的變化情況可以直接反映樣品的消化狀態(tài)，3個(gè)樣品分別經(jīng)口、胃以及在腸道中經(jīng)30、60、90、120 min消化過程中粒徑隨著消化時(shí)間的延長，各樣品的粒徑都呈現(xiàn)出不同程度的增長，與PE-0、PE-1相比，SE-1的最終消化粒徑要明顯小于其他兩者并且SE-1在整個(gè)消化過程中粒徑的均一性要明顯高于其他兩者，證明SE-1具有一定的緩釋作用。

3 結(jié)論

本研究建立了甾醇、谷維素在常溫下改變亞麻籽油流動(dòng)性的條件(甾醇 ∶谷維素=4∶6)，使其由液體轉(zhuǎn)變?yōu)榘牍腆w狀態(tài)。WPI和PPP-3為外殼，吐溫80做乳化劑，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶做固化劑制得3種不同的微膠囊油脂粉末PE-0、PE-1、SE-1。通過復(fù)溶后平均粒徑和Zeta電位、高溫保藏酸價(jià)、POV值分析及體外模擬消化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，酸性多糖PPP-3外殼包載有亞麻籽油的微膠囊粉末具有很好的理化性能并能顯著延緩亞麻籽油在儲(chǔ)藏期間的氧化敗壞，未包埋的亞麻籽油酸價(jià)在60 ℃儲(chǔ)藏時(shí)會(huì)快速的由0.04 mg/mL增長到2.32 mg/mL，而包埋的亞麻籽油微膠囊酸價(jià)會(huì)明顯降低。在模擬腸道階段消化速率和消化程度有明顯差異。SE-1由于帶負(fù)電的多糖排斥帶負(fù)電的脂肪酶與油脂接觸，SE-1的ALA釋放率(49.6±0.6)%要明顯低于PE-0的ALA釋放率(81.2±0.8)%，表明制備的SE-1具有良好的靶向控釋特性。

研究結(jié)果和思路對防止脂肪酸的氧化，降低脂肪酸氧化造成的食品安全風(fēng)險(xiǎn)，開發(fā)脂肪酸油脂粉末等功能性食品添加劑及包載具有特殊功能的不穩(wěn)定食品功能因子，實(shí)現(xiàn)可控緩釋具有很好的參考價(jià)值和借鑒意義。