顧仁勇 陳曉娟

(吉首大學化學化工學院，吉首 416000)

牡丹籽為毛茛科芍藥屬灌木牡丹的種子，含油量高達30%，并且富含不飽和脂肪酸[1]，是近年來大力發(fā)展的新木本油料資源。牡丹籽油于2011年被我國衛(wèi)生部批準為新資源食品，進一步促進了牡丹籽油產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。牡丹籽粕是牡丹籽制油后的主要副產(chǎn)物，含有多種營養(yǎng)成分及多糖、黃酮類化合物、單萜苷類、多酚等功能活性物質(zhì)[2,3]，因而具有重要的開發(fā)利用價值。

植物多酚類物質(zhì)因具有良好的抗氧化、降血壓、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、清除體內(nèi)自由基等生理和藥理活性[4-6]，成為研究熱點。多酚類物質(zhì)提取主要有溶劑提取、金屬離子沉淀、樹脂分離法和超臨界萃取等方法[7-10]。目前牡丹籽粕多酚的提取僅有溶劑提取的報道[11]，單純的溶劑浸提提取率較低，通常需要微波或超聲波輔助以提高提取效率。超臨界CO2萃取技術具有工藝簡單、萃取高效、產(chǎn)品性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點，在植物多酚的提取中得到了廣泛應用，但用于牡丹籽粕多酚提取及其抗氧化性研究鮮有報道。另外，由于多酚類物質(zhì)分子極性強，在CO2流體中的溶解度相對較低，添加乙醇等極性夾帶劑能有效提高對酚類的溶解能力，從而提高萃取效果。

本研究采用超臨界CO2萃取技術提取牡丹籽粕多酚，重點探討了夾帶劑、萃取溫度和萃取壓力對提取效果的影響，優(yōu)化了工藝參數(shù)，并測定了其體外抗氧化能力，可為牡丹籽粕多酚綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

牡丹籽粕：湖南優(yōu)鎰農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司。

福林-酚試劑(BR，1.0 mol/L)；沒食子酸標準品；DPPH；ABTS；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2450紫外-可見分光光度計；HA121-50-01超臨界CO2萃取裝置；F1-130藥物粉碎機；YZF-6250L真空干燥箱。

1.3 方法

1.3.1 超臨界CO2萃取牡丹籽粕多酚

牡丹籽粕真空干燥至含水量10%左右，粉碎，控制粉末粒度為80目[12]。稱粉料200 g，裝入萃取罐，按原料：夾帶劑(g/mL)=1∶1.2的量加入乙醇夾帶劑240 mL，浸潤30 min[13]，超臨界萃取2.5 h，收集萃取產(chǎn)物。按公式計算多酚提取量：

1.3.2 多酚含量測定1.3.2.1 標準曲線繪制[14]

配制質(zhì)量濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg/100 mL的沒食子酸標準品溶液，各取1.0 mL分別加入6支比色管中，依次加入0.5 mol/L的福林-酚試劑4.0 mL，再依次加入質(zhì)量分數(shù)12.0%的Na2CO3溶液5.0 mL，靜置2 h，于765 nm波長處測吸光度，繪制標準曲線，得吸光度(A)與沒食子酸質(zhì)量濃度(C)與的線性方程：A=1.004 3C-0.058(R2=0.997 5)，用于樣品中多酚含量測定。

1.3.2.2 產(chǎn)品多酚含量測定

取提取物樣品1.0 mL，加蒸餾水稀釋使其質(zhì)量濃度處于標準曲線的有效濃度范圍，吸取1.0 mL稀釋液，加入比色管，如標準曲線測定方法處理，于765 nm波長處測吸光度，重復3次，帶入回歸方程計算多酚含量。

1.3.3 萃取條件優(yōu)化實驗

選取乙醇(夾帶劑)體積分數(shù)(50%、60%、70%、80%、90%)、萃取溫度(40、45、50、55、60 ℃)和萃取壓力(20、25、30、35、40 MPa)3個因素的變量水平，進行單因素實驗，以多酚提取率為響應值，初步優(yōu)選萃取條件。在單因素實驗結(jié)果的基礎上，采用Box-Behnken響應面實驗設計對乙醇(夾帶劑)體積分數(shù)、萃取溫度和萃取壓力3個條件組合進行優(yōu)選。實驗因素水平見表1。

表1 因素水平表

1.3.4 抗氧化實驗1.3.4.1 DPPH·清除能力

參考文獻[15]方法略改動，配制不同質(zhì)量濃度牡丹籽粕多酚溶液，各取2.0 mL，加入0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液2.0 mL，充分混合，室溫下避光反應30 min，517 nm波長處測吸光度A1。按此法以等體積無水乙醇代替多酚溶液，測吸光度A2；以等體積無水乙醇代替DPPH溶液，測吸光度A3。以VC為參照，每組重復3次。計算DPPH·清除率。

1.3.4.2 ABTS+·清除能力

參考文獻[16]方法略改動，將7 mmol/mL的ABTS原液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合，常溫避光反應12～16 h，使用前用無水乙醇稀釋，使ABTS溶液在734nm處吸光值為(0.7±0.02)。取牡丹籽粕多酚提取液0.2 mL與2.4 mL ABTS溶液充分混勻，避光反應6 min，在734 nm處測吸光度A1，以無水乙醇代替多酚提取液測吸光度A。以VC為參照，每組重復3次。計算ABTS+·清除率。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Minitab16進行數(shù)據(jù)的方差分析及顯著性檢驗，采用Design-Expert 8.05進行Box-Behnken實驗設計及數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 乙醇(夾帶劑)體積分數(shù)對多酚提取量的影響

萃取溫度50 ℃、萃取壓力30 MPa，乙醇體積分數(shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%時牡丹籽粕多酚提取量見圖1。

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，余同。圖1 乙醇體積分數(shù)對多酚提取量的影響

由圖1可見，乙醇體積分數(shù)由50%逐步增加至80%時，多酚提取量由10.72 mg/g逐步提高至18.44 mg/g，提升效果顯著(P<0.05)，并達到最大值。酚類分子極性大，加入乙醇等極性夾帶劑能提升CO2流體對酚類的溶解能力，利于萃取[17,18]。乙醇體積分數(shù)大于80%，提取量反而有所降低，這可能是體積分數(shù)過大的夾帶劑也會使超臨界流體密度降低，而影響酚類的提取。因此，乙醇體積分數(shù)最佳為80%。

2.1.2 萃取溫度對多酚提取量的影響

圖2 萃取溫度對多酚提取量的影響

乙醇體積分數(shù)80%、萃取壓力30 MPa，萃取溫度分別為40、45、50、55、60 ℃時牡丹籽粕多酚提取量見圖2。萃取溫度由40 ℃逐步增大至50 ℃時，多酚提取量由12.86 mg/g逐步提高至18.43 mg/g，提升效果顯著(P<0.05)，并達到最大值；溫度繼續(xù)由50 ℃增至60 ℃，提取量反而顯著降低(P<0.05)。溫度升高一方面可增大被萃取物質(zhì)的擴散系數(shù)而提高提取量，同時也會降低CO2和夾帶劑密度，使被萃取物質(zhì)溶解度降低而降低萃取效果[17,18]。因此，選擇萃取溫度為50 ℃。

2.1.3 萃取壓力對多酚提取量的影響

乙醇體積分數(shù)80%、萃取溫度50 ℃，萃取壓力分別為20、25、30、35、40 MPa時牡丹籽粕多酚提取量見圖3。萃取壓力由20 MPa逐步增大至30 MPa時，多酚提取量由13.23 mg/g逐步提高至18.47 mg/g，提升效果顯著(P<0.05)，并達到最大值；壓力繼續(xù)增大時，提取量反而顯著降低(P<0.05)。萃取壓力升高，CO2流體密度增大，增加多酚類物質(zhì)的溶解及縮短分子間的傳質(zhì)距離，利于萃??；但壓力過高，溶質(zhì)的擴散系數(shù)減小，傳質(zhì)阻力增大，導致提取量降低[17,18]。因此，最優(yōu)萃取壓力為30 MPa。

圖3 萃取壓力對多酚提取量的影響

2.2 響應面優(yōu)化實驗結(jié)果

2.2.1 實驗方案及結(jié)果

依據(jù)單因素實驗結(jié)果，采用Box-Behnken響應面法，以多酚提取量為響應值，優(yōu)化乙醇(夾帶劑)體積分數(shù)、萃取溫度和萃取壓力3個條件。實驗結(jié)果見表2。

表2 響應面實驗設計及結(jié)果

2.2.2 方差分析

對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得牡丹籽粕多酚提取量(Y)與各因素回歸方程：

Y=18.22+0.53A+0.88B+0.74C+0.16AB-0.46AC-0.71BC-0.62A2-0.93B2-0.42C2

表3 回歸方程的方差分析

圖4各因素交互作用的響應面

據(jù)方差分析結(jié)果可判斷，因素A(乙醇體積分數(shù))、B(萃取溫度)、C(萃取壓力)對提取量均有極顯著影響(P<0.01)；二次項A2、B2存在極顯著影響(P<0.01)，C2存在顯著影響(P<0.05)，表明各因素對提取量存在顯著的曲線效應；因素交互項AC、BC對提取量影響極顯著(P<0.01)，AB影響不顯著(P>0.05)，表明因素AC、BC間存在極顯著的交互效應，AB間無交互效應；由F值可判斷，因素影響主次順序為：萃取溫度>萃取壓力>乙醇(夾帶劑)體積分數(shù)。

2.2.3 響應面分析

3個因素間交互作用響應面及等高線圖見圖4。響應面圖中某因素圖形變化坡度大，等高線密集，則表明該因素對響應值影響大；等高線接近橢圓表明兩因素交互影響大，接近圓形表示交互效應小[19]。

由圖4a可見，響應面圖中沿萃取壓力方向圖形坡度更為陡峭，等高線變化更加密集，表明萃取壓力的影響大于乙醇體積分數(shù)，對多酚提取量貢獻更大；等高線接近橢圓，表明乙醇體積分數(shù)和萃取壓力間交互效應明顯。同理，圖4b中萃取溫度的影響大于萃取壓力，對多酚提取量的貢獻更大，萃取溫度與萃取壓力間交互效應明顯；圖4c中，萃取溫度對提取量的影響和貢獻大于乙醇體積分數(shù)，等高線近圓形，表示兩因素交互效應不明顯。

2.2.4 最優(yōu)萃取條件的預測及驗證

利用回歸方程預測牡丹籽粕多酚最優(yōu)萃取條件為：乙醇體積分數(shù)83.34%、萃取溫度51.76 ℃、萃取壓力31.97 MPa，預測多酚提取量為18.61 mg/g。為了便于實際操作，將提取條件調(diào)整為：乙醇體積分數(shù)83%、萃取溫度52 ℃、萃取壓力32 MPa，以此條件進行驗證實驗，重復3次，提取量平均值18.58 mg/g，與預測值接近，表明回歸方程可靠，所得最優(yōu)萃取條件可用于牡丹籽粕多酚的提取。

2.3 抗氧化實驗結(jié)果

2.3.1 DPPH·清除實驗結(jié)果

配制質(zhì)量濃度30、60、90、120、150 μg/mL的牡丹籽粕多酚及VC溶液，測定其對DPPH·清除率，結(jié)果見圖5。在質(zhì)量濃度30～150 μg/mL范圍內(nèi)，牡丹籽粕多酚對DPPH·具有良好的清除能力，且隨著質(zhì)量濃度的增大，清除率由13.3%顯著增強至56.1%(P<0.05)。質(zhì)量濃度30～60 μg/mL間，同質(zhì)量濃度下牡丹籽粕多酚與VC對DPPH·的清除率無顯著差異(P>0.05)；質(zhì)量濃度大于90 μg/mL時，同質(zhì)量濃度下牡丹籽粕多酚對DPPH·的清除率顯著強于VC(P<0.05)，且兩者清除率的差異隨質(zhì)量濃度增大而增大。

分析表明牡丹籽粕多酚和VC質(zhì)量濃度與DPPH·的清除率間均存在極顯著的直線正相關(P<0.01，R2分別為0.982 6、0.986 2)，表明兩者抗氧化活性均存在明顯的量效關系。利用回歸方程計算抑制率為50%時牡丹籽粕多酚和VC的質(zhì)量濃度IC50分別為128.22 μg/mL和147.72 μg/mL，也表明牡丹籽粕多酚對DPPH·的清除能力顯著強于VC(P<0.05)。

圖5 牡丹籽粕多酚對DPPH·的清除率

2.3.2 ABTS+·清除實驗結(jié)果

配制質(zhì)量濃度30、60、90、120、150 μg/mL的牡丹籽粕多酚及VC溶液，測定其對ABTS+·清除率，結(jié)果見圖6。在質(zhì)量濃度30～150 μg/mL范圍內(nèi)，牡丹籽粕多酚對ABTS+·表現(xiàn)出良好的清除能力，且隨質(zhì)量濃度的增大清除率由25.1%顯著增強至64.2%(P<0.05)。同質(zhì)量濃度下牡丹籽粕多酚對ABTS+·的清除率顯著強于VC(P<0.05)，且兩者清除率的差值隨質(zhì)量濃度增大而增大。

圖6 牡丹籽粕多酚對ABTS+·的清除率

分析表明牡丹籽粕多酚和VC質(zhì)量濃度與ABTS+·清除率間均存在極顯著的直線正相關(P<0.01，R2分別為0.996 0、0.993 6)，表明兩者抗氧化活性存在明顯的量效關系。利用回歸方程計算牡丹籽粕多酚和VC對ABTS+·的IC50分別為109.18 μg/mL和142.66 μg/mL，也表明牡丹籽粕多酚對對ABTS+·的清除能力顯著強于VC(P<0.05)。

3 結(jié)論

超臨界萃取牡丹籽粕多酚最優(yōu)條件為：乙醇體積分數(shù)83%、萃取溫度52 ℃、萃取壓力32 MPa，此條件下提取量為18.58 mg/g。在超臨界CO2萃取牡丹籽粕多酚工藝條件中，萃取溫度與萃取壓力、乙醇(夾帶劑)體積分數(shù)與萃取壓力之間存在協(xié)同效應，合理優(yōu)化參數(shù)有利于提高牡丹籽粕多酚的提取量及產(chǎn)品的穩(wěn)定性。牡丹籽粕多酚對DPPH·和ABTS+·的清除能力均顯著強于VC。超臨界CO2萃取技術適用于牡丹籽粕多酚的提取，牡丹籽粕多酚可作為天然抗氧化活性劑和自由基清除劑開發(fā)利用。