徐方正 史素娟 毛靜靜 安璐璐 劉貫山 劉好寶 王倩

摘 ?要：為探究KNOX （KNOTTED1-like homeobox）家族基因在煙草葉片發(fā)育中的功能，從普通煙草（Nicotiana tobacum）紅花大金元中克隆獲得KNOX家族基因NtabKNOX8，對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了NtabKNOX8過表達(dá)材料，對轉(zhuǎn)生長素報(bào)告基因DR5：：GUS材料與NtabKNOX8過表達(dá)材料的雜交F1代葉片進(jìn)行了GUS染色。結(jié)果表明，NtabKNOX8屬于KNOX基因家族亞家族Ⅰ;過表達(dá)NtabKNOX8導(dǎo)致葉片變寬圓，對稱性喪失，葉面皺縮并向葉背面彎曲，主脈明顯縮短且脈序發(fā)生明顯改變，類似掌狀網(wǎng)脈，葉形指數(shù)變小，葉面積減小，比葉鮮重增大;NtabKNOX8過量表達(dá)的煙葉中生長素含量明顯增加，且分布更加廣泛。推測NtabKNOX8可能通過影響生長素的含量及分布，影響葉片生長發(fā)育過程，從而導(dǎo)致了煙葉形態(tài)的多重變化。

關(guān)鍵詞：KNOX基因;葉片發(fā)育;葉形;葉脈;生長素

Overexpression of NtabKNOX8 in Tobacco Causes Abnormal Leaf Development

XU Fangzheng1，2， SHI Sujuan1，2， MAO Jingjing1，2， AN Lulu1，2， LIU Guanshan1， LIU Haobao1， WANG Qian1*

（1. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China）

Abstract： In order to explore the function of KNOX family genes in tobacco leaf development， a KNOX family gene NtabKNOX8 was cloned from Nicotiana tobacum cv. Honghuadajinyuan and bioinformatics analysis was performed. Transgenic technique was performed to obtain NtabKNOX8 over-expression （OE） lines. And then GUS staining experiments were performed on the leaves of the hybrids （F1） of materials transferred into the auxin reporter DR5：：GUS and materials overexpressing NtabKNOX8. The results showed that NtabKNOX8 belongs to the KNOX family subfamily Ⅰ. Compared to the wild type tobacco plants， the NtabKNOX8 OE lines showed round and wrinkled leaves which curved toward the back and lost leaf symmetry. Meanwhile， the midrib of the two OE lines was greatly shortened and the venation changed significantly to palmately-netted venation-like type， with the leaf shape index and the leaf area decreased， leaf specific fresh weight increased. In addition， the auxin content was significantly increased while its distribution was more widely and extensive in the tobacco leaves overexpressing NtabKNOX8. It is suggested that NtabKNOX8 may regulate the growth and development of tobacco leaves by affecting the content and distribution of auxin， which finally leads to multiple changes in tobacco leaves.

Keywords： KNOX gene; leaf development; leaf shape; leaf vein; auxin

植物KNOX（KNOTTED1-like homeobox）家族基因編碼一類含有同源異型盒（homeobox，HOX）的轉(zhuǎn)錄因子，普遍參與調(diào)控植物的生長發(fā)育過程[1-2]。根據(jù)氨基酸序列、表達(dá)模式以及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，該家族可分為KNOX Ⅰ和KNOX Ⅱ兩個(gè)亞家族[3-6]。KNOX Ⅱ亞家族成員參與植物二倍體世代發(fā)育[7-8]、次生細(xì)胞壁的形成[9-12]和種子的物理休眠[13]，而KNOX Ⅰ亞家族基因是植物莖尖分生組織（shoot apical meristem，SAM）產(chǎn)生與維持必需的關(guān)鍵基因[14-15]，調(diào)控細(xì)胞分化，影響葉發(fā)育[16-17]、花發(fā)育[18] 和果實(shí)的形成[19-20]。KNOX Ⅰ亞家族有很多成員過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致植物葉片的異常發(fā)育[2]。例如，玉米ZmKN1過表達(dá)導(dǎo)致玉米在葉脈附近產(chǎn)生指節(jié)狀突起[21];擬南芥中過表達(dá)ZmKN1（Zea mays KNOTTED1）導(dǎo)致葉原基發(fā)育受限，在葉片邊緣產(chǎn)生裂片[22];在煙草中過表達(dá)水稻OSH15（Oryza sativa homeobox 15）、楊樹Pttkn1（Populus tremula×tremuloides KNOTTED1）均導(dǎo)致煙草葉片皺縮、葉的近軸面產(chǎn)生異位芽、葉脈脈序改變等異常發(fā)育表型[23-24]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，KNOX Ⅰ亞家族基因表達(dá)量升高所導(dǎo)致的葉片變態(tài)發(fā)育與生長素含量與分布的變化有關(guān)[25-26]。碎米薺KNOX基因的再激活導(dǎo)致其多裂葉葉緣的獨(dú)立小葉發(fā)育位點(diǎn)形成生長素最大值，最終形成多裂葉[25];玉米ZmKN1異位表達(dá)的葉片中，生長素響應(yīng)元件DR5rev驅(qū)動(dòng)紅色熒光蛋白基因（DR5rev：：mRFPer）的表達(dá)比野生型顯著增加[26]。

葉片是煙草的商品器官，煙葉的生長發(fā)育狀況直接影響烤后煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)，但目前煙草KNOX家族基因在煙葉發(fā)育方面的研究非常有限。1997年以來，從枯斑三生煙中陸續(xù)克隆了NTH15（Nicotiana tobacum homeobox 15）、NTH1、NTH9、NTH20、NTH22和NTH23等多個(gè)煙草KNOX家族基因。除過表達(dá)NTH23的煙草發(fā)育正常外，其他煙草KNOX家族基因的過表達(dá)均導(dǎo)致煙葉的異常發(fā)育[27-29]。但該類基因?qū)е碌臒熑~形態(tài)變化趨勢及其與生長素之間的關(guān)系未見報(bào)道。為進(jìn)一步明確KNOX家族基因在煙葉發(fā)育過程中對煙葉形態(tài)的影響，本研究從普通煙草（Nicotiana tobacum）紅花大金元中克隆到一個(gè)KNOX基因，通過轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)及表型觀察等測定分析其在煙葉發(fā)育中的作用，并初步探究其與生長素之間的關(guān)系，為了解煙草KNOX家族基因的作用機(jī)制提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料及試劑

試驗(yàn)于2018年6月至2019年10月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所進(jìn)行。供試品種紅花大金元和轉(zhuǎn)生長素報(bào)告基因DR5：：GUS煙草材料（以下簡稱DR5：：GUS）由本課題組自存。

試驗(yàn)所用菌株大腸桿菌DH5α、根癌農(nóng)桿菌EHA105、載體pCHF3均由本課題組自存。試驗(yàn)所用Taq聚合酶、載體pMD19-T、限制酶、DNA凝膠純化回收試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT-PCR Kit）等均購自寶生物工程有限公司。GUS染色液購自北京雷根生物技術(shù)有限公司。引物合成與測序由睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 ?試驗(yàn)方法

1.2.1 ?煙草NtabKNOX8基因的克隆及過表達(dá)NtabKNOX8煙草材料的獲得 ?熱酚法提取紅花大金元葉片總RNA[30]，參照PrimeScript RT-PCR Kit操作說明反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。參考美國國家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information， NCBI）收錄的栽培煙草KNOX序列NM_001326004.1，設(shè)計(jì)全長引物并引入Sac Ⅰ和Kpn Ⅰ酶切位點(diǎn)，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物純化回收后連入pMD19-T載體進(jìn)行測序。采用DNAMAN和NCBI Blast分析測序結(jié)果。將測序正確的基因片段酶切連入過表達(dá)載體pCHF3后，經(jīng)凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌[31]，然后采用葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化紅花大金元[30]，經(jīng)基因組PCR和RT-PCR檢測，鑒定獲得T0代過表達(dá)株系。本試驗(yàn)所采用的引物見表1。

1.2.2 ?過表達(dá)NtabKNOX8煙草材料的表型觀測 ?收獲T0代過表達(dá)植株自交種（T1代），消毒播種于1/2 MS平板（含50 mg/L硫酸卡那霉素），對照材料紅花大金元種子同時(shí)消毒播種于1/2 MS平板，25 d后選取長勢一致的轉(zhuǎn)基因抗性植株和對照材料移栽到裝有育苗基質(zhì)（草炭和蛭石1：1）的花盆中。自然光照，每2天澆水。

播種后44、51和61 d，每個(gè)材料選取長勢良好且一致的6棵煙株，選擇自下而上第4片葉片，用直尺測量葉片長、寬，計(jì)算葉形指數(shù)。測量結(jié)束后，將葉片剪下，用天平稱取鮮重，隨后排在同一水平面進(jìn)行拍照。所得圖片用Image J v1.52q處理，獲得葉面積，計(jì)算比葉鮮重（葉片鮮重/葉面積）。播種后80 d時(shí)，拍照記錄各材料表型。同時(shí)，采取每個(gè)材料自上而下第4片成熟葉，采用葉綠素清除實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)行觀察和拍照[24]，所得圖片采用Adobe Photoshop CC 2019進(jìn)行顏色反相處理以觀察脈序。

1.2.3 ?生長素含量及分布觀測 ?將DR5：：GUS（父本）分別與NtabKNOX8過表達(dá)材料（母本）和野生型紅花大金元（母本）雜交，獲得F1代材料35S：：NtabKNOX8×DR5：：GUS和HD×DR5：：GUS。將上述材料直接播種于育苗基質(zhì)中，播種后40 d時(shí)剪取其自上而下第1片葉（幼嫩葉）和第2片葉（成熟葉），參考北京雷根生物技術(shù)有限公司GUS染色液說明書進(jìn)行GUS染色。通過對比染色狀況，檢測葉片中生長素的含量及分布差異。

1.3 ?數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016和SPSS25軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用單因素ANOVA檢驗(yàn)-LSD方法進(jìn)行平均數(shù)的差異顯著性檢驗(yàn)（p<0.01）。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?普通煙草NtabKNOX8基因的克隆與生物信息學(xué)分析

參考NCBI GenBank No.NM_001326004.1序列設(shè)計(jì)引物，在普通煙草紅花大金元中擴(kuò)增到大小為984 bp的目的片段（圖1）。該片段可編碼一個(gè)由327個(gè)氨基酸組成的蛋白，推測分子量為36.7 kD，等電點(diǎn)為5.06。DNAMAN比對結(jié)果表明，該序列與NCBI數(shù)據(jù)庫的NM_001326004.1及中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫的Ntab0312890完全一致，參考劉向真等[32]的研究結(jié)果將其命名為NtabKNOX8。NCBI Blast結(jié)果表明，NtabKNOX8與枯斑三生煙NTH1（AF544052.1）、矮牽牛HERMIT-like protein 3（GQ409542.1）、番茄KN4（NM_001279346.2）的核酸序列相似度分別為98.47%、87.09%和85.68%，氨基酸序列相似性分別為98.17%、83.88%和71.76%。其中，NtabKNOX8與NTH1高度同源，屬于KNOX Ⅰ亞家族。

2.2 ?過表達(dá)NtabKNOX8導(dǎo)致煙葉皺縮且葉形變寬圓

本研究采用野生型紅花大金元（Honghuadajinyuan， HD）、NtabKNOX8過表達(dá)T1代抗性材料OE-1（over-expression line 1）和OE-2（over-expression line 2）3個(gè)煙草材料進(jìn)行表型觀察。OE-1和OE-2播種44 d前后，即表現(xiàn)有肉眼可見的葉片皺縮、對稱性喪失、葉形變寬圓的表型。隨著植株的發(fā)育，該表型更加明顯（圖2）。為更科學(xué)地展示葉片皺縮程度和葉形的變化，測量了各材料播種44、51和61 d的比葉鮮重、葉形指數(shù)和葉面積。播種44 d時(shí)，OE-1和OE-2與野生型材料的比葉鮮重均無顯著差異;播種51 d時(shí)，OE-1和OE-2的比葉鮮重均高于野生型，差異極顯著;播種61 d時(shí)，OE-1和OE-2的比葉鮮重與野生型差距進(jìn)一步擴(kuò)大，比野生型分別高53.3%、66.6%，差異達(dá)極顯著水平（圖3）。在播種后44、51和61 d，OE-1和OE-2葉形指數(shù)均低于野生型，且差異均達(dá)極顯著水平（圖4）。過表達(dá)材料與野生型的葉形指數(shù)差距隨生長時(shí)間延長逐漸增大，播種后61 d時(shí)，OE-1和OE-2的葉形指數(shù)分別比野生型低39.6%、41.5%。在播種后44、51和61 d，OE-1和OE-2的葉面積均低于野生型，并始終保持在野生型的一半左右，差異均達(dá)極顯著水平（圖5）。該試驗(yàn)表明，過表達(dá)NtabKNOX8嚴(yán)重影響煙草葉片的形態(tài)，導(dǎo)致葉面皺縮且葉形變寬圓，葉形指數(shù)變小、葉面積減少、比葉鮮重增大。

2.3 ?過表達(dá)NtabKNOX8導(dǎo)致煙葉主脈變短變彎且脈序類似掌狀網(wǎng)脈

剪取各材料的葉片主脈，將各材料葉片主脈以葉正面朝左、葉背面朝右的方向放置，進(jìn)行拍照。如圖6，與野生型相比，過表達(dá)材料葉片的主脈長度變短。并且，野生型煙葉主脈沒有明顯的彎曲，而過表達(dá)材料葉片的葉脈顯著向葉背面彎曲。同時(shí)比較了野生型與過表達(dá)材料在脈序上的差異。紅花大金元為羽狀網(wǎng)脈，而過表達(dá)材料的脈序顯著變化，側(cè)脈呈輻射狀，類似掌狀網(wǎng)脈（圖7）。試驗(yàn)表明，過表達(dá)NtabKNOX8嚴(yán)重影響了煙草的主脈形態(tài)和側(cè)脈分布，改變了煙草的脈序。

2.4 ?過表達(dá)NtabKNOX8導(dǎo)致煙葉生長素含量顯著提高且分布更廣泛

參照1.2.3分別獲得了35S：：NtabKNOX8×DR5：：GUS和HD×DR5：：GUS煙草材料，利用GUS化學(xué)染色法進(jìn)行GUS活性檢測。結(jié)果表明（圖8），在兩種F1代材料中均檢測到GUS活性，但幼嫩和成熟葉片中，35S：：NtabKNOX8×DR5：：GUS材料葉片的GUS活性整體上明顯高于對照，且分布更加廣泛。在幼嫩葉片中，對照煙草葉片的GUS活性普遍較低，而35S：：NtabKNOX8×DR5：：GUS材料在葉片主脈基部和部分側(cè)脈區(qū)域檢測到很強(qiáng)的GUS活性。在成熟葉片中，對照煙草葉片在葉基部和葉尖區(qū)域檢測到一定程度的GUS活性，而35S：：NtabKNOX8× DR5：：GUS材料除在葉基部和葉尖部位檢測到明顯加強(qiáng)的GUS活性外，在葉片的主、側(cè)脈及脈間也檢測到明顯的GUS活性。該結(jié)果表明，過表達(dá)NtabKNOX8導(dǎo)致煙草葉片生長素含量顯著提高且分布更加廣泛。

3 ?討 ?論

煙草是以煙葉為主要收獲器官的作物，不同的煙制品對煙葉大小和形狀有不同的要求。SAKAMOTO等[28]的研究表明，過表達(dá)NtabKNOX8的同源基因NTH1導(dǎo)致葉片輕微發(fā)育紊亂，但尚未明確葉片的具體形態(tài)變化。NtabKNOX8與NTH1高度同源，其過表達(dá)也導(dǎo)致煙葉出現(xiàn)相似表型。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步分析了這種葉片發(fā)育異常在葉形上的具體表現(xiàn)，測定了過表達(dá)NtabKNOX8后煙草在葉形指數(shù)、比葉重和葉面積3個(gè)形態(tài)指標(biāo)的變化趨勢，為根據(jù)不同生產(chǎn)要求定向調(diào)控?zé)煵萑~形提供了一定的研究數(shù)據(jù)。已有研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥KNOX Ⅰ亞家族基因BREVIPEDICELLUS在SAM中促進(jìn)細(xì)胞分裂，而在維管束中則促進(jìn)木質(zhì)部纖維的分化[33-34]。本研究中過表達(dá)NtabKNOX8所致煙草材料的葉脈形態(tài)變化，是由SAM中細(xì)胞分裂異常還是木質(zhì)部纖維分化加劇引起，還需要更多的試驗(yàn)數(shù)據(jù)闡明。

植物的遺傳改良依賴于對有關(guān)數(shù)量性狀遺傳體系以及其中個(gè)別重要基因的研究。張興偉等[35]利用“主基因+多基因”混合遺傳模型的6個(gè)世代聯(lián)合分離分析方法，分析了烤煙葉形指數(shù)、比葉重和葉面積等的遺傳體系。本研究首次明確了過表達(dá)

NtabKNOX8對烤煙數(shù)量性狀葉形指數(shù)、比葉重和葉面積的影響，與上述遺傳體系相結(jié)合，為煙草的遺傳改良提供了基本數(shù)據(jù)。宋健等[36]的研究表明，葉面褶皺程度、主側(cè)脈夾角等數(shù)量性狀的表現(xiàn)與外界環(huán)境條件密切相關(guān)，在不同時(shí)期基因的表達(dá)也會(huì)出現(xiàn)差異，因此研究相關(guān)基因的順序性表達(dá)對揭示煙草發(fā)育的遺傳規(guī)律具有重要意義。本研究僅探究了組成型過表達(dá)NtabKNOX8對葉片形態(tài)的影響，關(guān)于內(nèi)源NtabKNOX8在煙草不同生育期的表達(dá)尚需進(jìn)一步研究。

相關(guān)研究表明，玉米ZmKN1可以直接與參與生長素合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因結(jié)合，且該基因在玉米葉片中的異位表達(dá)導(dǎo)致葉片皺縮，皺縮葉片中DR5rev：：mRFPer的表達(dá)比野生型顯著增加[26]。與該研究結(jié)果一致，過表達(dá)NtabKNOX8基因?qū)е氯~片皺縮和DR5：：GUS的表達(dá)增加，說明NtabKNOX8可能通過類似機(jī)制導(dǎo)致生長素的積累。推測NtabKNOX8可能參與調(diào)節(jié)生長素的含量與分布，進(jìn)而導(dǎo)致了過表達(dá)材料在葉片形態(tài)方面的多重變化。此外，已有研究表明KNOX蛋白參與植物體內(nèi)多種激素含量的調(diào)節(jié)，包括生長素、赤霉素和細(xì)胞分裂素[1]。這些生長調(diào)節(jié)物質(zhì)均可影響煙葉的生理特性[37]。本研究僅探究了NtabKNOX8過表達(dá)材料中生長素含量與分布的變化，關(guān)于過表達(dá)NtabKNOX8導(dǎo)致的葉形變化是否有其他激素參與，仍需進(jìn)一步探究。

4 ?結(jié) ?論

本研究首次從普通煙草紅花大金元中克隆獲得一個(gè)KNOX Ⅰ亞家族基因NtabKNOX8。過表達(dá)NtabKNOX8導(dǎo)致煙葉皺縮，葉形指數(shù)變小、葉面積減少、比葉鮮重增大，葉片生長素含量明顯增加且分布更為廣泛。推測過表達(dá)NtabKNOX8可能通過調(diào)節(jié)生長素含量與分布，導(dǎo)致煙葉形態(tài)的改變。本研究為煙草的遺傳改良和定向調(diào)控?zé)煵萑~形提供了一定的研究數(shù)據(jù)。關(guān)于NtabKNOX8如何參與調(diào)節(jié)葉片各組織的發(fā)育過程、調(diào)控生長素的含量與分布及其過表達(dá)導(dǎo)致的葉形變化是否有其他激素參與等科學(xué)問題，仍需更加深入的研究。

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