吳維棟 黃麟 吳煒焊

[摘要]目的 探討大鼠建立氣管異位移植慢性閉塞性細(xì)支氣管炎模型后的病理變化及不同階段白細(xì)胞介素-17（IL-17）的表達(dá)情況。方法 選取24只清潔級(jí)SD大鼠，其中SPF級(jí)近交系Brown Norway（BN）大鼠6只，Lewis大鼠18只，隨機(jī)選取12只Lewis大鼠納入對(duì)照組，將剩余的6只Lewis大鼠與6只BN大鼠納入觀察組。觀察組BN大鼠提供氣管，Lewis大鼠接受氣管;對(duì)照組的12只Lewis大鼠既是供體也是受體。比較兩組大鼠的軟骨損傷率、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、大鼠閉塞性細(xì)支氣管炎的發(fā)生率以及IL-17水平。結(jié)果 移植術(shù)后，觀察組大鼠閉塞性細(xì)支氣管炎的發(fā)生率為100.00%，高于對(duì)照組的0.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。兩組大鼠移植后第7天的軟骨損傷率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;觀察組大鼠移植后第14、28天的軟骨損傷率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;觀察組大鼠移植第7、14、28天后的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。兩組大鼠移植后第7、14天的IL-17水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;觀察組大鼠移植后第28天的IL-17水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 通過建立大鼠異位氣管慢性排斥反應(yīng)模型，提示異位氣管移植后，大鼠的IL-17水平升高，有關(guān)IL-17導(dǎo)致的閉塞性炎性反應(yīng)機(jī)制還應(yīng)繼續(xù)試驗(yàn)與研究。

[關(guān)鍵詞]大鼠;異位氣管移植;動(dòng)物模型;閉塞性細(xì)支氣管炎;白細(xì)胞介素-17

[Abstract] Objective To investigate the pathological changes and the expression of IL-17 （IL-17） in different stages of chronic bronchiolitis obliterans model after heterotopic tracheal transplantation in rats. Methods Twenty-four clean-grade SD rats were selected， of which 6 were brown Norway （BN） and 18 were Lewis. Twelve Lewis rats were randomly selected into the control group， and the remaining six Lewis rats and six BN rats were included into the observation group. The BN rats in observation group provided trachea， Lewis rats received trachea; and the 12 Lewis rats in control group were both donor and receptor. The cartilage injury rate， lymphocyte count， incidence of bronchiolitis obliterans and the level of IL-17 were compared between the two groups. Results After transplantation， the incidence of bronchiolitis obliterans in the observation group was 100.00%， higher than that in the control group （0.00%）， with statistically significant difference （P<0.05）. There was no statistically significant difference in the cartilage damage rate between the two groups on the 7th day after transplantation （P>0.05）. On the 14th and 28th days after transplantation， the cartilage damage rates in the observation group were higher than those in the control group， with statistically significant differences （P<0.05）. After 7， 14 and 28 days of transplantation， the lymphocyte counts in the observation group were more than those in the control group， with statistically significant differences （P<0.05）. There were no statistically significant differences in the levels of IL-17 between the two groups on the 7th and 14th days after transplantation （P>0.05）. The level of IL-17 in the observation group was higher than that in the control group on the 28th day after transplantation， with statistically significant difference （P<0.05）. Conclusion Through the establishment of the model of chronic rejection of ectopic trachea in rats， it is suggested that the level of IL-17 in rats increased after the transplantation of ectopic trachea， and the mechanism of occlusive inflammatory response induced by IL-17 should be further studied.

[Key words] Rat; Heterotopic tracheal transplantation; Animal model; Obliterative bronchiolitis; Interleukin-17

隨著科技的進(jìn)步，醫(yī)學(xué)也在不斷發(fā)展，肺移植治療技術(shù)也慢慢成熟，最初療效得到了臨床肯定，但是該治療技術(shù)存在一定的后期問題，移植手術(shù)經(jīng)過1年和5年的生存率分別為80.0%、50.0%左右[1]。當(dāng)前面對(duì)的難題是有關(guān)肺移植手術(shù)治療后所出現(xiàn)的慢性排斥反應(yīng)，它的主要表現(xiàn)就是閉塞性支氣管炎，也就是肺移植治療后發(fā)生的進(jìn)行性小氣道功能紊亂，這種情況具有危險(xiǎn)性，嚴(yán)重的會(huì)危及生命[2]。針對(duì)閉塞性細(xì)支氣管炎發(fā)病的情況還沒有統(tǒng)一的定論，還比較局限，所以建立動(dòng)物模型研究實(shí)驗(yàn)是很有必要的。臨床對(duì)促炎因子的研究比較深入，但是在肺移植之后的慢性排斥反應(yīng)研究不多，不能證明激活炎性反應(yīng)的一系列機(jī)制，應(yīng)該繼續(xù)深入研究[3]。本文構(gòu)建大鼠氣管異位移植慢性閉塞性細(xì)支氣管炎模型，旨在觀察其病理變化及白細(xì)胞介素-17（IL-17）的表達(dá)情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1對(duì)象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取24只清潔級(jí)SD大鼠，購于華中科技大學(xué)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：99A032。大鼠均為雄性，重量250～350 g，其中SPF級(jí)近交系Brown Norway（BN）大鼠6只，Lewis大鼠18只。隨機(jī)選取12只Lewis大鼠納入對(duì)照組，將剩余的6只Lewis大鼠與6只BN大鼠納入觀察組。本研究已經(jīng)動(dòng)物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑

冰箱、手術(shù)顯微鏡、手術(shù)所用的一些器械均由上海醫(yī)療器械提供;手術(shù)所需要的針線、試劑等均由上海醫(yī)用縫合針廠提供。

1.3方法

實(shí)驗(yàn)的整個(gè)過程都需要在無菌的條件下進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食6 h，并且相關(guān)所有共組需要全部消毒。

1.3.1觀察組? ①供體手術(shù)：BN大鼠以10%水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20180126，規(guī)格：4 ml/kg）腹腔麻醉，頸胸部消毒，正中切口暴露氣管，取下整段主氣管，剝除氣管外膜組織，斷端修剪平整，5環(huán)1段為供體，4℃生理鹽水沖洗干凈后浸泡備用[4]。②受體手術(shù)：Lewis大鼠麻醉消毒后暴露頸段氣管，環(huán)狀軟骨下第4、5環(huán)間為中心上下各分離兩環(huán)氣管，充分游離氣管后間隙，小心剝離并保護(hù)喉返神經(jīng)[5]。于第4、5環(huán)間切開氣管，留膜部1/5部段。吸凈氣管內(nèi)分泌物后植人入供體氣管。先吻合尾側(cè)，膜部對(duì)膜部，軟骨部對(duì)軟骨部，于12點(diǎn)處以7-0尼龍線縫合1針，打結(jié)后剪斷膜部，再于3、9點(diǎn)處各縫合1針，最后縫合6點(diǎn)處[6]。吻合頭側(cè)時(shí)先縫合膜部，最后縫合12點(diǎn)處完成氣管移植。術(shù)后60 d形成OB模型。③術(shù)前準(zhǔn)備：消毒，選擇和胸骨間隔0.5 cm且支出距離為2.0 cm的切口，將氣管和周圍的組織進(jìn)行分離，然后下移支氣管，再進(jìn)行縫合工作，最后消毒，消毒是至關(guān)重要的，一切操作都要在無菌條件下進(jìn)行，為了防止在手術(shù)中感染[7]。

1.3.2對(duì)照組? Lewis大鼠既是供體也是受體，所有操作與觀察組相同。

1.4觀察指標(biāo)

比較兩組大鼠的軟骨損傷率、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、大鼠閉塞性細(xì)支氣管炎的發(fā)生率以及IL-17水平。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組大鼠閉塞性細(xì)支氣管炎發(fā)生率的比較

移植術(shù)后，觀察組大鼠閉塞性細(xì)支氣管炎的發(fā)生率為100.00%（12/12），高于對(duì)照組的0.00%（0/12），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2兩組大鼠移植后不同時(shí)間軟骨損傷率、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較

兩組大鼠移植后第7天的軟骨損傷率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;觀察組大鼠移植后第14、28天的軟骨損傷率高于移植后第7天，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)多于移植后第7天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;對(duì)照組大鼠移植后第14天的軟骨損傷率高于移植后第7天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。觀察組大鼠移植后第14、28天的軟骨損傷率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;觀察組大鼠移植第7、14、28天后的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.3兩組大鼠移植后不同時(shí)間IL-17水平的比較

兩組大鼠移植后第7、14天的IL-17水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;兩組大鼠移植后第14、28天的IL-17水平高于移植后第7天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;觀察組大鼠移植后第28天的IL-17水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

3討論

閉塞性細(xì)支氣管炎常發(fā)生于肺移植后，是進(jìn)行性小氣管功能紊亂疾病，該病的特點(diǎn)是咳嗽、肺功能下降、呼吸困難等，延緩疾病的發(fā)展是治療該病的主要方法，不能徹底根治[8-10]。引起閉塞性支氣管炎的原因沒有統(tǒng)一定論，目前臨床認(rèn)為是由非免疫性損傷、同種異體損傷等造成管腔里纖維細(xì)胞增生所致[7]。國外在閉塞性細(xì)支氣管炎的有關(guān)研究中，將大鼠氣管移植分成3個(gè)階段予以研究，與人類肺移植非常相似：①在缺血期做人體肺移植手術(shù)時(shí)很容易發(fā)生出血所導(dǎo)致的缺血癥狀，同時(shí)伴隨著上皮細(xì)胞死亡，黏膜水腫等癥狀;②出現(xiàn)淋巴細(xì)胞性支氣管炎癥狀，主要是由于淋巴細(xì)胞被感染導(dǎo)致的;③閉塞性氣道疾病，即上皮細(xì)胞死亡消失后，纖維組織將管腔阻塞，人類也是以同樣的方式發(fā)生肺移植后的閉塞性支氣管炎[11-13]。

IL-17主要是經(jīng)過誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞，讓其分泌炎性因子，對(duì)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生刺激，從而細(xì)胞再生，在炎性反應(yīng)過程中起到非常重要的作用[14-16]。除此以外，對(duì)支氣管泡腔、肺內(nèi)等不同地方的中性粒細(xì)胞也起到一定效果，讓細(xì)胞大量地聚集在一起，同時(shí)對(duì)氣道內(nèi)皮生長因子起到一定作用，IL-17不僅促進(jìn)肺移植后氣道的愈合，還能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[17];同時(shí)起到增強(qiáng)中性粒細(xì)胞蛋白酶、增強(qiáng)髓過氧化酶等效果。相關(guān)研究顯示，控制IL-17分泌能夠減輕肺移植治療中導(dǎo)致的閉塞性支氣管纖維化程度[18-20]。本研究結(jié)果顯示，兩組大鼠移植后第7、14天的IL-17水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;觀察組大鼠移植后第28天的IL-17水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;移植術(shù)后，觀察組大鼠閉塞性細(xì)支氣管炎的發(fā)生率為100.00%，高于對(duì)照組的0.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示異位氣管移植后，IL-17水平不斷發(fā)生變化，但是其導(dǎo)致的閉塞性炎性機(jī)制還要進(jìn)一步的研究和實(shí)驗(yàn)來證實(shí)[15]。

綜上所述，建立氣管異位移植慢性閉塞性細(xì)支氣管炎模型后，大鼠的IL-17水平升高，有關(guān)IL-17導(dǎo)致的閉塞性炎性反應(yīng)機(jī)制還有待進(jìn)一步試驗(yàn)與研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Verleden GM，Raghu G，Meyer KC，et al.A new classification system for chronic lung allograft dysfunction[J].Heart Lung Transplant，2014，33（2）：127-133.

[2]Yusen RD.The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation：thirty-first adult lung and heart-lung transplant report-2014;focus theme： retransplantation[J].J Heart Lung Transplant，2014，33（10）：1009-1024.

[3]Pain M，Bermudez O，Lacoste P，et al.Tissue remodelling in chronic bronchial diseases：from the epithelial to mesenchymal phenotype[J].Eur Respir Rev，2014，23（131）：118-130.

[4]張翀，虞莉，呂望.大鼠上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和肺移植后閉塞性細(xì)支氣管炎的相關(guān)性[J].中華胸心血管外科雜志，2016， 32（7）：411-414.

[5]李娜，何葉，李敏超.機(jī)械壓力敏感性通道蛋白表達(dá)水平與COPD患者氣道重塑的關(guān)聯(lián)性分析[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2016，42（2）：277-282.

[6]江科，王建軍，陳軍，等.改良的大鼠左肺原位移植模型[J].中國胸心血管外科臨床雜志，2006，13（5）：335-337.

[7]張俊，王勝，王建軍，等.大鼠左肺原位移植模型手術(shù)技術(shù)改進(jìn)[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2010，39（3）：381-382.

[8]劉理靜，錢紅，尹輝明，等.IL-17 單克隆抗體對(duì)肺纖維化大鼠的保護(hù)作用及部分機(jī)制研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2015， 25（11）：1586-1592.

[9]萬勇，張念，李劍平，等.調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞與Th17細(xì)胞的失衡及其對(duì)大鼠肺纖維化的影響[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2013，42（2）：161-166.

[10]張皓，齊海.肺移植動(dòng)物模型：損傷、保護(hù)及免疫反應(yīng)[J].中國組織工程研究，2014，24（5）：797-802.

[11]陳寧，徐燕，張永紅，等.慢性阻塞性肺病大鼠外周血中Foxp3+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞及IL-17、IL-6水平的變化[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2014，24（27）：24-28.

[12]Maasilta P，Salminen US，Taskinen E，et al.Obliterative airway disease in a porcine heterotopic bronchial allograft model[J].Transpl Int，2000，13（3）：218-224.

[13]鮑文華，梁建合，李樹民，等.Th17 細(xì)胞和IL-23、IL-17軸在肺纖維化大鼠肺組織動(dòng)態(tài)表達(dá)的意義[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2014，27（3）：240-244.

[14]Rangel-Moreno J，Carragher DM，de la Luz Garcia-Hernandez M，et al.The development of inducible bronchus associated lymphoid tissue depends on IL-17[J].Nat Immunol，2011，12（7）：639-646.

[15]吳維棟，雷成剛，朱勇，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)閉塞性支氣管炎的治療作用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2017，34（1）：75-78.

[16]劉茂林，曹建軍，劉偉，等.IL-17在大鼠異位氣管移植的慢性閉塞性細(xì)支氣管炎中的表達(dá)和作用研究[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2017，16（20）：1983-1986.

[17]汪路明.LTB4相關(guān)通路及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化對(duì)肺移植后閉塞性細(xì)支氣管炎的作用[D].杭州：浙江大學(xué)，2017.

[18]吳東，李小軍，劉茂林，等.大鼠氣管異位移植慢性排斥反應(yīng)模型的建立及其與白細(xì)胞介素17的關(guān)系[J].中國組織工程研究，2015，19（49）：8010-8014.

[19]劉茂林.大鼠氣管異位移植慢性排斥反應(yīng)模型的建立和其與IL-17的關(guān)系[D].武漢：華中科技大學(xué)，2013.

[20]王光鎖.供體脾細(xì)胞聯(lián)合抗CD154輸注誘導(dǎo)小鼠肺移植慢性排斥反應(yīng)免疫耐受基因表達(dá)譜研究[D].武漢：華中科技大學(xué)，2009.

（收稿日期：2019-06-05? 本文編輯：閆? 佩）