把小云，王祎婷，常秀林，段乳俠，方廖瓊，△

（1超聲醫(yī)學工程國家重點實驗室，重慶醫(yī)科大學生物工程學院，重慶400016；2西南大學生物技術學院，重慶400716）

腫瘤并非孤立的實體，其生存發(fā)展涉及到復雜微環(huán)境，正如一個多世紀之前的“種子和土壤”假說［1］，腫瘤細胞（種子）離不開微環(huán)境（土壤）的支持，腫瘤微環(huán)境是由基質細胞、分泌因子、細胞外基質組分、外泌體等構成的復雜體系［2-3］，其中外泌體是介導腫瘤細胞間通訊的特殊媒介，可攜帶親本細胞的蛋白質、核酸等信息物質傳遞給靶細胞，賦予靶細胞“新的”生物學功能［3］。研究表明，實體組織中較為豐富的成纖維細胞可以在腫瘤外泌體的介導下由正常成纖維細胞轉化為腫瘤相關成纖維細胞（cancer associated fibroblasts，CAF）而觸發(fā)細胞外基質重塑，分泌多種生長因子和趨化因子，從而促進腫瘤細胞的侵襲轉移過程［4］，但具體的機制還未明確。值得一提的是，Ras相關C3肉毒毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1）蛋白可以參與CAF介導的腫瘤微環(huán)境重塑以增強腫瘤細胞的侵襲能力。Rozenchan等［5］研究表明CAF內Rac1蛋白表達水平顯著高于正常成纖維細胞，且Rac1的表達水平與乳腺癌細胞入侵淋巴結的活躍性正相關。本課題組前期的研究表明小鼠黑色素瘤B16-F10細胞外泌體可誘導小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）侵襲能力的表達［6］，這提示我們B16-F10細胞外泌體是影響MEF侵襲性表征改變的重要介質，但具體的分子機制還有待深入研究。本研究是在此基礎上通過建立B16-F10細胞外泌體與MEF共培養(yǎng)體系，檢測共培養(yǎng)后MEF中Rac1蛋白表達水平變化，初步探索了B16-F10細胞外泌體影響MEF中Rac1蛋白表達的情況，為后期深入研究B16-F10細胞外泌體影響MEF侵襲的機制提供參考資料。

材料和方法

1 動物

SPF級雌性C57BL/6小鼠（孕13.5 d）由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

2 細胞和主要試劑

小鼠黑色素瘤B16-F10細胞購自中國科學院上海細胞庫。DMEM和RPMI-1640培養(yǎng)液購自Hy-Clone；胎牛血清購自ExCell Bio；腫瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101，Tsg101）和酪氨酸酶相關蛋白2（tyrosinase-related protein 2，Tyrp2）抗體購自Abcam；Rac1抗體購自Affinity；DAPI染色液購自碧云天；PKH26染色試劑購自Sigma；兔二步法檢測試劑盒（兔增強聚合物法檢測系統(tǒng)）PV9001和DAB顯色試劑盒（ZLI-9018）購自中杉金橋公司。

3 主要方法

3.1 B16-F10細胞培養(yǎng)及外泌體制備 使用含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)B16-F10細胞，并在37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內進行常規(guī)培養(yǎng)。參考Théry等［7］制備外泌體的方法：預先將胎牛血清100 000×g超高速離心8 h去除胎牛血清中的外泌體，用含10%去除外泌體的胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)B16-F10細胞，待細胞在75 cm2的細胞瓶中匯合度達到80%左右，棄上清液，PBS清洗2次，換成去除外泌體的胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細胞培養(yǎng)上清液300×g（4℃）離心 10 min，棄沉淀。上清液 2 000×g（4℃）離心15 min，棄沉淀。上清液5 000×g（4℃）離心15 min，棄沉淀。上清液100 000×g（4℃）離心70 min，收集沉淀，加入PBS緩沖液，100 000×g（4℃）離心70 min，收集沉淀，所得即為外泌體。

3.2 MEF的原代提取及培養(yǎng) 選擇孕期在12～14 d的C57BL/6小鼠頸椎脫臼致死，在無菌條件下取出胚胎，去除胚胎頭部，尾部，四肢及內臟部分。用剪刀將剩余部分剪碎，反復研磨后，置于37℃，用0.25%胰蛋白酶處理5 min，胎牛血清終止消化，120目過濾篩篩除去顆粒性組織塊，將過濾后懸液96×g離心5 min，棄上清，細胞沉淀用含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM完全培養(yǎng)液重懸，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內進行常規(guī)培養(yǎng)。

3.3 納米顆粒跟蹤分析（nonoparticle tracking analysis，NTA）檢測粒徑分布 將離心后的外泌體沉淀溶于1 mL的PBS中，渦旋使其盡可能均勻分布，將其稀釋至1×1012/L的外泌體懸液，取1 mL外泌體懸液置于干凈的比色皿內，使用Malvern Panalytical粒度儀檢測B16-F10細胞外泌體粒徑分布情況。

3.4 透射電鏡負染色觀察外泌體形態(tài)特征 將離心后的外泌體沉淀溶于1 mL的PBS中，渦旋使其盡可能均勻分布，將其稀釋至1×1012/L的外泌體懸液，用100 μL微量注射器吸取外泌體懸液，取10 μL滴在銅網上，過夜晾干，晾干后的銅網上滴加10 μL醋酸雙氧鈾溶液，吸去多余液體，染色2 min，雙蒸水潤洗，晾干后用透射電鏡觀察。

3.5 Western blot實驗檢測外泌體特征蛋白Tsg101和Tyrp2及MEF中Rac1蛋白表達水平 準備適量外泌體及MEF樣本，用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解10 min后，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度，取10 μg總蛋白量的蛋白提取液加入loading buffer，煮沸90 s使蛋白變性，進行SDS-PAGE，110 V恒壓轉膜90 min，5%BSA封閉后加入I抗（Tsg101、Tyrp2和Rac1抗體）4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的II抗室溫孵育2 h，清洗后ECL法顯色，采用ImageJ軟件進行灰度值統(tǒng)計。

3.6 激光共聚焦顯微鏡觀察MEF攝取外泌體過程 避光條件下，使用稀釋后的PKH26染色液對外泌體的磷脂雙分子膜進行染色5 min，加入適量胎牛血清終止染色后添加PBS重懸外泌體沉淀，100 000×g（4℃）離心70 min，除去多余染色液。收集離心后的外泌體沉淀，在共聚焦皿中將外泌體和MEF共培養(yǎng)0、12、24和36 h。待共培養(yǎng)結束，棄細胞培養(yǎng)上清液，PBS清洗，加入4%多聚甲醛避光固定；避光條件下進行DAPI染細胞核；棄去DAPI染色液，加入抗熒光淬滅液，共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

3.7 免疫細胞化學染色實驗檢測Rac1蛋白表達預先將細胞接種至鋪有爬片的6孔板內，置于孵箱內使其貼壁后進行MEF與B16-F10細胞外泌體共培養(yǎng)0、12、24和36 h。待共培養(yǎng)結束，PBS清洗MEF后固定30 min，0.5%Triton X-100通透細胞，加入內源性過氧化物酶阻斷劑進行封閉處理，37℃孵育I抗，經反應增強液孵育后，室溫孵育II抗，DAB顯色液顯色，蘇木素復染，自來水沖洗、脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察，ImageJ軟件分析每張爬片的陽性表達水平并進行統(tǒng)計學分析。

4 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，GraphPad Prism 7.0軟件作圖。每組實驗均重復3次。計量資料采用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 B16-F10細胞外泌體結構特征

超速離心法制備的B16-F10細胞外泌體通過透射電鏡負染色觀察可見，外泌體呈典型茶托狀形態(tài)特征，見圖1A；Malvern Panalytical粒度儀檢測結果表明，B16-F10細胞外泌體的粒徑分布范圍在141～255 nm處，見圖1B；Western blot檢測到B16-F10細胞外泌體表達Tsg101和Tyrp2蛋白，見圖1C。

Figure 1.Identification of B16-F10 cell-derived exosomes.A：exosomes were confirmed by negative-staining transmission electron microscopy（scale bar=100 nm）；B：exosome particle size distribution was quantified by Malvern Panalytical particle size analyzer；C：Western blot for determing the protein expression of tumor susceptibility gene 101（Tsg101）and tyrosinaserelated protein 2（Tyrp2）in the exosomes.圖1 B16-F10細胞外泌體的鑒定

2 MEF攝取B16-F10細胞外泌體

激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，與共培養(yǎng)0 h相比較，共培養(yǎng)12 h的MEF胞質內出現(xiàn)了少量PKH26標記的B16-F10細胞外泌體，共培養(yǎng)24和36 h的MEF胞質及核周圍聚集了大量PKH26標記的B16-F10細胞外泌體，見圖2。這表明隨著時間增加，MEF攝取B16-F10細胞外泌體的能力有所增強。

Figure 2.Uptake of B16-F10 cell-derived exosomes by MEF was observed under laser confocal microscope（scale bar=50 μm）.The nuclei were labeled by DAPI，while the exosomes were labeled by PKH26.A：co-culture at 0 h；B：co-culture at 12 h；C：co-culture at 24 h；D：co-culture at 36 h.圖2 MEF攝取B16-F10細胞外泌體

3 B16-F10細胞外泌體促進MEF表達Rac1蛋白

免疫細胞化學染色實驗檢測結果中Rac1陽性表達為棕黃色；與共培養(yǎng)0 h相比較，共培養(yǎng)12、24和36 h的MEF內Rac1陽性表達呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢（P＜0.05或P＜0.01），見圖3A。Western blot實驗結果顯示，與共培養(yǎng)0 h相比較，共培養(yǎng)24和36 h的MEF中Rac1蛋白表達水平顯著增加（P＜0.01），見圖3B。這些結果均證明黑色素瘤B16-F10細胞外泌體能夠促進MEF中Rac1蛋白表達。

討 論

Figure 3.B16-F10 cell exosomes promoted the expression of Rac1 protein in MEF.A：immunocytochemical staining（scale bar=50 μm）；B：Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 h group.圖3 B16-F10細胞外泌體促進MEF表達Rac1蛋白

黑色素瘤源于表皮黑素細胞的惡性轉化，是最具侵襲性的皮膚癌之一，預后極差，一旦侵襲轉移，5年內的存活率為5%［8］。近年來，隨著研究的深入，研究人員證明黑色素瘤細胞外泌體攜帶豐富的蛋白質、核酸、脂質等細胞來源的信息分子，可直接充當細胞間通訊的媒介，改造周圍基質細胞轉變?yōu)槟[瘤微環(huán)境的組成部分，促進黑色素瘤細胞的侵襲轉移［9］。有研究表明，具有高度轉移性的B16-F10細胞外泌體通過致癌蛋白MET（受體酪氨酸激酶）可導致骨髓祖細胞具有腫瘤惡性表型特征，促進了原發(fā)性腫瘤的轉移行為［10］，這表明高度轉移性的B16-F10細胞外泌體可以改造正常細胞的生物學功能。本課題組前期致力于研究黑色素瘤細胞外泌體是如何營造有利于黑色素瘤細胞生存發(fā)展的微環(huán)境，基于成纖維細胞是大多數(shù)實體組織中最豐富的基質細胞，具有在一定條件下轉變?yōu)镃AF的潛力，成為腫瘤微環(huán)境的重要組分，我們證明了小鼠黑色素瘤B16-F10細胞外泌體能夠影響正常胚胎成纖維MEF侵襲性改變［6］，但有關B16-F10細胞外泌體如何影響MEF侵襲性的具體機制還未探索，有待深入探究。

Rac1蛋白可以調節(jié)黑色素瘤細胞肌動蛋白骨架重組，形成侵襲偽足，降解細胞外基質，促進細胞的侵襲轉移［11-12］。近年來大量的研究表明在結腸癌［13］、乳腺癌［14］、黑色素瘤［12］等多種惡性腫瘤細胞中 Rac1蛋白表達水平較高，且其表達水平與細胞的侵襲能力緊密相關。Lee等［15］的研究表明膽脂瘤上皮中Rac1的mRNA的表達水平相比于正常皮膚平均增加2.94倍，且Rac1的異常的表達促進上皮細胞的侵襲性。Tian等［16］的研究表明在黑色素瘤B16細胞內高表達水平的Rac1蛋白會誘導F-肌動蛋白聚合，觸發(fā)上皮-間充質轉化，進一步增強了細胞的侵襲性。Zhang等［17］通過生物學信息分析證明了黑色素瘤B16-F10細胞外泌體內Rac1蛋白表達水平較高。因此，本研究通過建立B16-F10細胞與MEF共培養(yǎng)體系證明攝取了B16-F10細胞外泌體的MEF中Rac1蛋白表達水平有所升高，但究竟是B16-F10細胞外泌體釋放Rac1蛋白到MEF，還是外泌體內的某種活性成分調節(jié)MEF內Rac1蛋白表達升高，以及B16-F10細胞外泌體是通過Rac1的哪種信號通路調控MEF的侵襲過程等方面還需要更深入的研究。

綜上所述，本研究初步證明了黑色素瘤B16-F10細胞外泌體可促進MEF表達Rac1蛋白。這為本課題組后期探索黑色素瘤細胞外泌體導致成纖維細胞侵襲性改變的機制奠定了基礎。下一步我們將重點研究黑色素瘤B16-F10細胞外泌體是否通過Rac1相關信號途徑促進MEF的侵襲能力。