楊棟勇，徐 源，樊冀閩，朱志興，張華平

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，福建泉州362000）

肺癌是全球常見的發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤，手術(shù)結(jié)合放化療是傳統(tǒng)的治療方法，雖有一定療效，但術(shù)后轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，放化療抵抗性的出現(xiàn)限制了其療效，因此需要尋找新發(fā)治療方式。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，靶向治療成為治療肺癌的新方法，而尋找新型驅(qū)動基因和有效藥物靶點是肺癌靶向治療的關(guān)鍵［1-2］。研究表明長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）與肺癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后等密切相關(guān)，可作為肺癌診斷標(biāo)志及治療的特異性靶點［3-4］。LINC01503是一種新的lncRNA，研究顯示LINC01503在結(jié)直腸癌組織中顯著上調(diào)，敲除LINC01503表達顯著抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖和侵襲［5］。敲除LINC01503減少了鱗狀細胞癌的增殖、集落形成、遷移和侵襲［6］。研究報道上調(diào)miR-335表達可有效抑制非小細胞肺癌細胞的生長，降低細胞侵襲能力，并且促進細胞的凋亡［7］。此外，miR-335-5p過表達顯著抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲［8］?；贚INC01503和miR-335-5p都可影響腫瘤的進展，通過調(diào)節(jié)其表達具有抗腫瘤作用，且miR-335-5p還與肺癌的發(fā)展過程相關(guān)，然而LINC01503對肺癌細胞活力、遷移和侵襲的影響及LINC01503是否通過miR-335-5p影響肺癌細胞的活力、遷移和侵襲，尚未可知。本實驗旨在研究LINC01503對肺癌細胞活力、遷移和侵襲的影響及其機制是否與miR-335-5p有關(guān)，在體外細胞層面研究與肺癌進展相關(guān)的可能分子機制，為以后肺癌分子水平的治療提供一定的參考和依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 臨床組織標(biāo)本來源 選取本院2017年1月～2019年1月間經(jīng)病理檢測為肺癌且具有完整臨床資料的患者40例，其中I/II期患者和III/IV期患者各20例患者手術(shù)前均未進行手術(shù)及放化療，距離腫瘤組織邊緣2～5 cm處切除為瘤旁正常組織，所有患者均知情且同意。

1.2 細胞與主要試劑 正常支氣管上皮細胞系BEAS-2B及肺癌細胞系H1299、A549和SPC-A-1購自中國科學(xué)院上海細胞庫。胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)液和胰蛋白酶購自Gibico；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen；TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自TaKaRa；DMSO、BCA試劑盒和PBS緩沖液購自Sigma；抗體購自北京博奧森生物科技有限公司；MTT試劑盒、雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒、RIPA蛋白裂解液和SDS-PAGE試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室和Matrigel購于BD。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) BEAS-2B、H1299、A549和SPC-A-1細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，隔天換液1次，選取處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

2.2 細胞轉(zhuǎn)染與分組 取肺癌細胞H1299用0.25%胰蛋白酶消化后接種于96孔板中，待細胞生長至80%融合，更換為無血清培養(yǎng)液同步化12 h，隨后進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為si-NC組（轉(zhuǎn)染si-NC）、si-LINC01503組（轉(zhuǎn)染si-LINC01503）、pcDNA組（轉(zhuǎn)染pcDNA）、pcDNA-LINC01503組（轉(zhuǎn)染 pcDNALINC01503）、miR-NC組（轉(zhuǎn)染miR-NC）、miR-335-5p組（轉(zhuǎn)染 miR-335-5p mimics）、si-LINC01503+antimiR-NC組（共轉(zhuǎn)染si-LINC01503和anti-miR-NC）和si-LINC01503+anti-miR-335-5p組（共轉(zhuǎn)染 si-LINC01503和anti-miR-335-5p），轉(zhuǎn)染按照 LipofectamineTM2000試劑盒進行操作。

2.3 RT-qPCR檢測miR-335-5p和LINC01503表達水平 收集各組細胞，提取總RNA，微量核酸測定儀檢測RNA純度和濃度。使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照TaKaRa熒光定量試劑盒說明書操作步驟進行PCR擴增，每個樣品設(shè)3個重復(fù)。循環(huán)條件為：95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)；60℃延長5 min。相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。具體引物序列見附件。

2.4 Western blot檢測蛋白的表達 提取各組細胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入相應(yīng)的I抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入II抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液、晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達水平。每個蛋白樣品設(shè)3個重復(fù)。

2.5 MTT檢測細胞活力 在各組細胞培養(yǎng)至24 h、48 h和72 h時加入20 μL（5 g/L）的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h；棄去多余培養(yǎng)液并加入150 μL DMSO振蕩反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度（A）值。細胞活性（%）=實驗組A值/空白對照組A值×100%。

2.6 Transwell檢測細胞遷移和侵襲 各組細胞胰酶消化后用無血清培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整濃度為2×107/L。細胞遷移實驗：取200 μL細胞懸液接種于Transwell小室上室中，并置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，取出小室，去除培養(yǎng)液后用棉簽輕輕擦去上層細胞，PBS洗滌，加入4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗滌，顯微鏡觀察并拍照計數(shù)。細胞侵襲實驗：以1∶5比例加入RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋Matrigel后，鋪于Transwell小室的上室，室溫下干燥后，按照細胞遷移實驗步驟操作。最后顯微鏡下觀察結(jié)晶紫染色細胞數(shù)即為侵襲細胞數(shù)。

2.7 螢光素酶報告基因?qū)嶒灆z測LINC01503對miR-335-5p的靶向調(diào)控 TargetScan數(shù)據(jù)庫顯示LINC01503的3′-UTR有miR-335-5p結(jié)合位點。構(gòu)建野生型和突變型基因靶點LINC01503的3′UTR螢光素酶表達載體WT-LINC01503和MUTLINC01503，取對數(shù)生長期的H1299細胞接種于24孔板（每孔5×104個），待細胞生長至80%融合時，用LipofectamineTM2000將WT-LINC01503和MUTLINC01503組細胞分別轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-335-5p。依據(jù)說明書要求，使用螢光素酶報告基因檢測儀進行雙螢光素酶報告實驗測定。實驗結(jié)果以螢火蟲螢光素酶活性和海腎螢光素酶活性的比值進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.00進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（x±s）表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 LINC01503和miR-335-5p在肺癌組織中的表達

與正常肺組織相比，肺癌組織中LINC01503表達水平顯著升高，miR-335-5p表達水平顯著降低（P＜0.05）；與Ⅰ/Ⅱ期階段相比，Ⅲ/Ⅳ期肺癌組織中LINC01503表達水平顯著升高，miR-335-5p表達水平顯著降低（P＜0.05）；LINC01503高表達的患者生存率顯著低于LINC01503低表達的患者（P＜0.05），見圖1。

2 LINC01503和miR-335-5p在肺癌細胞和正常支氣管上皮細胞中的表達

與人正常支氣管上皮細胞系BEAS-2B相比，人肺癌細胞系H1299、A549和SPC-A-1中miR-335-5p的表達水平顯著降低，LINC01503的表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖2。

3 抑制LINC01503表達對肺癌H1299細胞活力的影響

與si-NC組相比，si-LINC01503組肺癌細胞H1299中LINC01503表達水平顯著降低，cyclin D1表達水平顯著降低，p21和p27表達水平顯著升高，肺癌細胞H1299活力顯著降低（P＜0.05），見圖3。

4 抑制LINC01503表達對肺癌H1299細胞遷移和侵襲的影響

與si-NC組相比，si-LINC01503組肺癌細胞H1299遷移和侵襲數(shù)量顯著降低，MMP-2、MMP-9和MMP-14蛋白的表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖4。

5 miR-335-5p過表達對肺癌H1299細胞活力、遷移和侵襲的影響

Figure 1.Expression of LINC01503 and miR-335-5p in lung cancer tissues.A：expression of LINC01503 in lung cancer tissues；B：expression of miR-335-5p in lung cancer tissues；C：expression of LINC01503 in different stages of lung cancer；D：expression of miR-335-5p in different stages of lung cancer；E：survival curve of patients with different expression levels of LINC01503.Mean±SD.n=20.*P＜0.05vsnormal group；#P＜0.05vsstage I/II group.圖1 LINC01503和miR-335-5p在肺癌組織中的表達

Figure 2.Expression of LINC01503 and miR-335-5p in lung cancer cells and normal bronchial epithelial cells.A：expression of LINC01503 in lung cancer cells and normal bronchial epithelial cells；B：expression of miR-335-5p in lung cancer cells and normal bronchial epithelial cells.Mean±SD.n=20.*P＜0.05 vs BEAS-2B group.圖2 LINC01503和miR-335-5p在肺癌細胞和正常支氣管上皮細胞中的表達

Figure 3.Effect of inhibition of LINC01503 expression on the viability of lung cancer H1299 cells.A：relative expression of LINC01503；B：effect of inhibition of LINC01503 expression on the viability of lung cancer H1299 cells；C：effect of inhibition of LINC01503 expression on the expression of cell cycle-related proteins in lung cancer H1299 cells.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs si-NC group.圖3 抑制LINC01503表達對肺癌H1299細胞活力的影響

Figure 4.Effect of inhibition of LINC01503 expression on migration and invasion of lung cancer H1299 cells.A：inhibition of LINC01503 expression reduced the migratory and invasive lung cancer H1299 cell numbers；B：effect of inhibition of the expression of LINC01503 on the expression of migration-and invasion-related proteins in lung cancer H1299 cells.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs si-NC group.圖4 抑制LINC01503表達對肺癌H1299細胞遷移和侵襲的影響

與miR-NC組相比，miR-335-5p組肺癌細胞H1299中miR-335-5p的表達水平顯著升高，肺癌細胞H1299活力顯著降低，肺癌細胞H1299遷移和侵襲數(shù)量顯著降低，cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達水平顯著降低，p21表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖5。

Figure 5.Effect of miR-335-5p overexpression on viability，migration and invasion of lung cancer H1299 cells.A：relative expression of miR-335-5p；B：effect of miR-335-5p overexpression on viability of lung cancer H1299 cells；C：effect of miR-335-5p overexpression on migration and invasion of lung cancer H1299 cells；D：effect of miR-335-5p overexpression on cell cycle-，migration-and invasion-related proteins in lung cancer H1299 cells.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs miR-NC group.圖5 miR-335-5p過表達對肺癌H1299細胞活力、遷移和侵襲的影響

6 LINC01503靶向調(diào)控miR-335-5p的表達

通過starBase在線軟件預(yù)測到LINC01503與miR-335-5p存在結(jié)合位點，見圖6A。螢光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生型LINC01503基因表達載體WT-LINC01503后，相較于miR-NC組，miR-335-5p組WT-LINC01503肺癌細胞H1299的螢光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；而轉(zhuǎn)染突變型LINC01503基因表達載體MUT-LINC01503后，相較于miR-NC組，miR-335-5p組MUT-LINC01503肺癌細胞H1299的螢光素酶活性無顯著差異，見圖6B。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，相較于si-NC組，si-LINC01503組肺癌細胞H1299中miR-335-5p的表達水平顯著升高（P＜0.05）；相較于pcDNA組，pcDNA-LINC01503組肺癌細胞H1299中miR-335-5p的表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖6C。

Figure 6.LINC01503 targeted and regulated miR-335-5p expression.A：LINC01503 contains a nucleotide sequence complementary to miR-335-5p；B：dual-luciferase reporter assay；C：LINC01503 regulated the expression of miR-335-5p.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs miR-NC group；#P＜0.05 vs pcDNA group；&P＜0.05 vs si-NC group.圖6 LINC01503靶向調(diào)控miR-335-5p的表達

7 干擾miR-335-5p表達逆轉(zhuǎn)了抑制LINC01503表達對H1299細胞活力、遷移和侵襲的作用

與si-NC組相比，si-LINC01503組H1299細胞中miR-335-5p的表達水平顯著升高，H1299細胞活力顯著降低，遷移和侵襲數(shù)量顯著降低，cyclin D1、MMP-2和MMP-9表達水平顯著降低，p21表達水平顯著升高（P＜0.05）；與si-LINC01503+anti-miR-NC組相比，si-LINC01503+anti-miR-335-5p組H1299細胞中miR-335-5p的表達水平顯著降低，H1299細胞活性顯著升高，H1299細胞遷移和侵襲數(shù)量顯著升高，cyclin D1、MMP-2和MMP-9表達水平顯著升高，p21表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖7。

討 論

lncRNA可以通過多種作用機制調(diào)控腫瘤的轉(zhuǎn)移過程［9］，也與肺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移、侵襲及肺癌患者預(yù)后等密切相關(guān)［10］。lncRNA LINC01503在膠質(zhì)瘤組織和細胞中上調(diào)表達，敲除其表達可抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲，促進細胞凋亡［11］。LINC01503還參與早期宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［12］。本實驗研究結(jié)果顯示，LINC01503在肺癌組織中高表達，且Ⅲ/Ⅳ期肺癌組織中LINC01503表達水平高于Ⅰ/Ⅱ期肺癌組織；而LINC01503高表達的患者短期生存率低于LINC01503低表達的患者，說明LINC01503在肺癌組織中的高表達與肺癌患者的分期和生存期相關(guān)，LINC01503可能參與肺癌的發(fā)生發(fā)展過程。本實驗通過進行體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)LINC01503在肺癌細胞中也高表達，抑制LINC01503表達后，cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平降低，細胞活力和遷移、侵襲數(shù)量顯著降低，說明抑制LINC01503表達可抑制肺癌細胞活力、遷移和侵襲。LINC01503不僅影響肺癌細胞活力、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)行為，還肺癌分期和生存期有關(guān)。

有研究顯示下調(diào)miR-335-5p可促進胃癌細胞增殖和侵襲［13］。且有研究報道m(xù)iR-335-5p在非小細胞肺癌組織和細胞中下調(diào)表達，過表達miR-335-5p下調(diào)ROCK1表達抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和克隆形成［14］，以上結(jié)果表明miR-335-5p在腫瘤中可能作為抑癌因子起作用，其表達缺失或下調(diào)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本實驗結(jié)果顯示，miR-335-5p在肺癌細胞中顯著低表達，過表達miR-335-5p抑制cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達，抑制肺癌細胞H1299活力、遷移和侵襲。此外，在肺癌組織中miR-335-5p也顯著低表達，且Ⅲ/Ⅳ期肺癌組織中miR-335-5p表達水平低于Ⅰ/Ⅱ期肺癌組織。本實驗結(jié)果與前人研究結(jié)果相符，以上結(jié)果表明miR-335-5p參與肺癌的進展，與肺癌細胞的惡性生物學(xué)行為和肺癌的分期相關(guān)。

Figure 7.Interfering with miR-335-5p expression reversed the effect of inhibiting LINC01503 expression on viability，migration and invasion of H1299 cells.A：relative expression of miR-335-5p；B：interfering with miR-335-5p expression reversed the effect of inhibiting LINC01503 expression on viability of H1299 cells；C：interfering with miR-335-5p expression reversed the effect of inhibiting LINC01503 expression on migration and invasion of H1299 cells；D：interfering with miR-335-5p expression reversed the effect of inhibiting LINC01503 expression on the expression of cell cycle-，migration-and invasionrelated proteins in H1299 cells.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs si-NC group；#P＜0.05 vs si-LINC01503 group.圖7 干擾miR-335-5p表達逆轉(zhuǎn)了抑制LINC01503表達對H1299細胞活力、遷移和侵襲的作用

近年來研究顯示lncRNA可作為競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）結(jié) 合miRNA調(diào)控其下游靶基因的表達，進而調(diào)控惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程［15］。lncRNA TUG1通過作為miR-335-5p的ceRNA促進骨肉瘤細胞遷移和侵襲［16］。lncRNA SLCO4A1-AS1通過海綿狀miR-335-5p促進膀胱癌的生長和侵襲［17］。這說明miR-335-5p可作為lncRNA的靶標(biāo)，兩者共同影響腫瘤的進展。本實驗通過在線軟件預(yù)測顯示LINC01503與miR-335-5p存在結(jié)合位點，雙螢光素酶報告實驗進一步證明LINC01503與miR-335-5p存在靶向關(guān)系，LINC01503可靶向調(diào)控miR-335-5p；且干擾miR-335-5p表達能逆轉(zhuǎn)抑制LINC01503表達對肺癌細胞H1299活力、遷移和侵襲的抑制作用，說明LINC01503可能通過可作為ceRNA結(jié)合miR-335-5p影響肺癌細胞的活力、遷移和侵襲。

綜上所述，抑制lncRNA LINC01503表達可抑制肺癌細胞的活力、遷移和侵襲，其機制可能與靶向調(diào)控miR-335-5p有關(guān)。在體外細胞層面研究了其可能的分子機制，為以后在分子水平研究治療肺癌的手段提供了依據(jù)。