曾凱輝，呂慧瑩，羅金泰，趙子良△

（1廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院麻醉科，2廣州市越秀區(qū)光塔街社區(qū)衛(wèi)生服務中心，3廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科，廣東廣州510120）

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)中常見的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年增長，且復發(fā)率高［1］，因此尋找一種能夠治療膀胱癌的藥物具有重要意義。普魯卡因（procaine，PCA）是一種局麻藥物，但在許多疾病的臨床治療中有廣泛的應用，如呼吸科、婦產科、皮膚科和神經科疾病以及惡性腫瘤等［2］。CXC趨化因子受體7（CXC chemokine receptor 7，CXCR7）是一種趨化因子受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，與膀胱癌的臨床分期和預后相關［3］，并參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4］。蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）是PI3K/AKT信號通路中的關鍵蛋白，調控其下游增殖、侵襲和轉移的相關信號，AKT磷酸化后才被激活［1-5］。有研究發(fā)現(xiàn)，AKT信號通路可能是CXCR7發(fā)揮作用的關鍵通路［6］，CXCR7能夠激活AKT信號通路，抑制腫瘤細胞的凋亡［7］。信號轉導和轉錄激活因子 3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）磷酸化后可調控下游靶基因，在細胞信號轉導中起關鍵作用［8-9］。本實驗研究了PCA及CXCR7對膀胱癌細胞生長、遷移和侵襲的影響，并分析了PCA和CXCR7之間的關系以及它們對AKT/STAT3信號通路的影響，為膀胱癌的預防和治療提供新靶點并為藥物治療提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 材料與試劑

人膀胱癌RT4細胞購自中國科學院上海細胞庫。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco；RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒購自TaKaRa；Taq DNA Polymerase和AceQ qPCR SYBR?Green Master Mix購自南京諾唯贊生物公司；細胞計數(shù)試劑盒8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）、蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；PCA購自武漢鑫佳靈生物科技有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) RT4細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2恒溫箱培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。

2.2 PCA處理膀胱癌細胞 取對數(shù)生長期的RT4細胞消化后接種于96孔板（每孔1×104個），DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，吸去原培養(yǎng)液，換成含不同濃度（0、0.25、1、4和16 mmol/L）PCA的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h，根據(jù)不同實驗需求收集細胞。

2.3 細胞分組和轉染 PCA實驗分為PBS組和PCA組，以未經PCA處理的RT4細胞作為PBS組，以4 mmol/L PCA處理的RT4細胞作為PCA組；CXCR7敲減實驗分為siRNA陰性對照（siRNA negative control，si-Con）組和CXCR7siRNA（si-CXCR7）組，將si-Con和si-CXCR7分別轉染到RT4細胞中；CXCR7過表達實驗分為PBS組、PCA組、PCA+pcDNA組和PCA+pcDNA-CXCR7組，前2組與PCA實驗中相同處理，后2組的處理為將pcDNA和pcDNA-CXCR7分別轉染至4 mmol/L PCA處理的RT4細胞中。轉染均按照LipofectamineTM2000試劑盒進行操作。

2.4 RT-qPCR分析CXCR7的mRNA表達水平 按照TRIzol說明書提取總RNA，用反轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，按照AceQ qPCR SYBR?Green Master Mix說明書進行RT-qPCR擴增。循環(huán)條件為95℃30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，共40個循環(huán)；60℃延長5 min。目的基因的相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。CXCR7的上游引物序列為5′-TGGGTGGTCAGTCTCGT-3′，下游引物序列為5′-CCGGCAGTAGGTCTACT-3′；內參照β-actin的上游引物序列為5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游引物序列為5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。

2.5 CCK-8法測定RT4細胞活力的變化 分別取不同濃度PCA處理的對數(shù)生長期細胞消化后，接種于96孔板（每孔5×103個）培養(yǎng)，分別于24、48和72 h培養(yǎng)時點，每孔加入10 μL CCK-8試劑繼續(xù)孵育2 h。取si-Con組、si-CXCR7組、PCA+pcDNA組和PCA+pcDNA-CXCR7組的對數(shù)生長期細胞消化后，接種于96孔板（每孔5×103個）培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑繼續(xù)孵育2 h。酶標儀測定各孔波長450 nm處的吸光度（A），另設單孔只加培養(yǎng)基作為空白對照。細胞活力（%）=A實驗組/A空白對照組×100%。以上實驗重復3次。

2.6 Transwell實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力收集各組穩(wěn)定表達的膀胱癌RT4細胞，采用無血清培養(yǎng)基制備細胞懸液，接種于Transwell小室上層（每孔3×103個細胞）。Transwell小室風干后，加入500 μL 0.1%結晶紫染色，顯微鏡下拍照并計數(shù)發(fā)生遷移的細胞數(shù)量。細胞侵襲實驗參考賀晶等［10］的方法，在Transwell小室上層加入50 μL 2.0 g/L基質膠Matrigel，凝固后接種RT4細胞，之后操作同細胞遷移。

2.7 Western blot法檢測蛋白水平 收集穩(wěn)定表達的各組RT4細胞，提取細胞中總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白總量。各組蛋白上樣量為60 μg，經SDSPAGE分離后，經電轉將蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，加入I抗，4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5 min；再加入相對應的II抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，然后在暗室中顯影，定影。用Tanon 600系統(tǒng)進行拍照分析，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達水平。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，兩組間比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 不同濃度的PCA對RT4細胞活力的影響

CCK-8法檢測結果顯示，與對照組相比，不同濃度PCA處理后RT4細胞的活力顯著降低（P＜0.05），見圖1。這一結果表明，PCA可抑制RT4細胞的活力。

Figure 1.The viability of the RT4 cells treated with procaine at different concentrations.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs 0 mmol/L group.圖1 不同濃度普魯卡因對RT4細胞活力的影響

2 PCA對RT4細胞遷移和侵襲能力的影響

Transwell實驗的檢測結果顯示，相較于PBS組，PCA組遷移和侵襲的RT4細胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05），見圖2。這表明PCA可抑制RT4細胞的遷移和侵襲能力。

3 PCA對RT4細胞CXCR7表達的影響

RT-qPCR檢測結果顯示，相較于PBS組，PCA組膀胱癌RT4細胞中CXCR7的mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖3A。Western blot檢測結果顯示，相較于PBS組，PCA組RT4細胞中CXCR7蛋白的表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖3B?？梢奝CA抑制膀胱癌RT4細胞CXCR7的表達。

4 敲減CXCR7表達對RT4細胞的活力、遷移和侵襲的影響

RT-qPCR檢測結果顯示，相較于si-Con組，si-CXCR7組RT4細胞中CXCR7的mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖4A；Western blot檢測結果顯示，相較于si-Con組，si-CXCR7組RT4細胞中CXCR7蛋白的表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖4B；CCK-8法檢測結果顯示，相較于si-Con組，si-CXCR7組RT4細胞的活力顯著降低（P＜0.05），見圖4C；Transwell法檢測結果顯示，相較于si-Con組，si-CXCR7組遷移和侵襲的RT4細胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05），見圖4D、E。這表明抑制CXCR7表達可抑制RT4細胞的活力、遷移和侵襲。

5 過表達CXCR7逆轉PCA對RT4細胞活力、遷移和侵襲的抑制作用

Figure 2.Procaine（PCA）inhibited the migration（A）and invasion（B）abilities of the RT4 cells.The migration and invasion of the RT4 cells were detected by Transwell assays（×200）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs PBS group.圖2 普魯卡因抑制RT4細胞的遷移和侵襲

Figure 3.Procaine（PCA）inhibited CXCR7 expression in the RT4 cells.A：the mRNA expression of CXCR7 in the RT4 cells was detected by RT-qPCR；B：the protein expression of CXCR7 in the RT4 cells was detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs PBS group.圖3 普魯卡因抑制RT4細胞中CXCR7的表達

RT-qPCR檢測結果顯示，相較于PBS組，PCA組RT4細胞中CXCR7的mRNA表達水平顯著降低；相較于PCA+pcDNA組，PCA+pcDNA-CXCR7組RT4細胞中CXCR7的mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖5A。Western blot檢測結果顯示，相較于PBS組，PCA組RT4細胞中CXCR7的蛋白表達水平顯著降低；相較于PCA+pcDNA組，PCA+pcDNA-CXCR7組RT4細胞中CXCR7的蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖5B。CCK-8實驗結果顯示，相較于PBS組，PCA組RT4細胞的活力顯著降低；相較于PCA+pcDNA組，PCA+pcDNA-CXCR7組RT4細胞的活力顯著升高（P＜0.05），見圖5C。Transwell實驗結果顯示，相較于PBS組，PCA組遷移和侵襲的RT4細胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05）；相較于PCA+pcDNA組，PCA+pcDNA-CXCR7組遷移和侵襲的RT4細胞數(shù)量顯著增多（P＜0.05），見圖5D、E。上述結果表明，過表達CXCR7可逆轉PCA對RT4細胞活力、遷移和侵襲的抑制作用。

6 過表達CXCR7和PCA對RT4細胞AKT/STAT3信號通路的影響

Western blot的檢測結果顯示，相較于PBS組，PCA組p-AKT和p-STAT3的蛋白水平顯著降低；相較于PCA+pcDNA組，PCA+pcDNA-CXCR7組p-AKT和p-STAT3的蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；而AKT和STAT3蛋白水平在各組之間的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖6。上述結果表明，PCA抑制RT4細胞中AKT和STAT3的磷酸化，而過表達CXCR7可逆轉PCA對AKT和STAT3磷酸化的抑制作用。

討 論

Figure 4.Knock-down of CXCR7 expression inhibited the viability，migration and invasion of the RT4 cells.A：the mRNA expression of CXCR7 in the RT4 cells was detected by RT-qPCR；B：the protein expression of CXCR7 in the RT4 cells was detected by Western blot；C：the viability of the RT4 cells was detected by CCK-8 assay；D，E：the migration and invasion abilities of the RT4 cells were detected by Transwell assays（×200）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs si-Con group.圖4 敲減CXCR7的表達抑制RT4細胞的活力、遷移和侵襲

膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過程復雜，研究膀胱癌的分子遺傳學基礎可給臨床診斷、治療和預后預測提供理論依據(jù)［11］。PCA是一個有前景的抗腫瘤藥物，還可以拮抗化療相關的腎臟和肝臟毒性［12-13］。研究表明高溫聯(lián)合PCA可在體外凈化白血病骨髓［14］。研究發(fā)現(xiàn) PCA 對人鼻咽癌 CNE-2Z細胞［15］和HepG2細胞［16］具有抑制增殖的作用。CXCR7參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，張娜等［4］研究發(fā)現(xiàn)CXCR7通過抗凋亡因子survivin參與胃癌的生長，并可能參與胃癌的淋巴結轉移。研究發(fā)現(xiàn)CXCR7在宮頸癌細胞中高表達，抑制CXCR7表達可抑制宮頸癌細胞的增殖和侵襲能力［17］，在神經母細胞瘤中具有抗腫瘤功能［18］。抑制CXCR7表達，前列腺癌細胞增殖減少［19］，并可減少腎癌細胞的遷移及侵襲［20］。林靈［21］的研究發(fā)現(xiàn)靶向干擾CXCR7表達可通過抑制Akt的磷酸化、下調bcl-2表達、上調多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶1［poly（ADP-ribose）polymerase-1，PARP-1］表達從而介導細胞凋亡的發(fā)生。

AKT在細胞存活、代謝、遷移和侵襲等信號通路中起著重要的調控作用，其在多種腫瘤中異?；罨?2-23］。AKT能磷酸化一系列蛋白成分，通過多種途徑抑制細胞凋亡［24］。理論上靶向AKT基因抑制AKT的活性能夠抑制腫瘤細胞的生長，因此抑制AKT的激活對腫瘤治療有重要意義［25］。STAT3信號轉導通路在膀胱癌的增殖、凋亡、侵襲和轉移調控中發(fā)揮重要作用，異常高表達的磷酸化STAT3可能通過增加血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達來促進腫瘤血管的生成，導致膀胱腫瘤惡性進展，靶向阻斷STAT3信號通路為膀胱癌的治療提供新的思路［26］。黃陳等［27］研究發(fā)現(xiàn)阻斷STAT3信號轉導通路可抑制人胰腺癌細胞增殖，促進其凋亡。CXCL-8可通過ATK和STAT3信號通路提高骨髓間充質干細胞自噬和增殖能力［28］。來偉等［29］研究發(fā)現(xiàn) PRL-3能通過白細胞介素 6（interleukin-6，IL-6）上調p-AKT和p-STAT3促進結腸癌細胞增殖和遷移。趙勇［30］研究發(fā)現(xiàn)Hes1可通過激活PI3K/AKT和JAK/STAT3信號通路，減輕缺氧后心肌細胞凋亡，從而減輕心肌細胞缺血在灌注損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)，PCA處理及敲減CXCR7的表達可使膀胱癌RT4細胞的活力、遷移和侵襲能力顯著降低，說明PCA和CXCR7可能影響膀胱癌的發(fā)展過程。在PCA處理后的RT4細胞中轉入CXCR7過表達表質?？赡孓DPCA對膀胱癌細胞的活力、遷移和侵襲能力的抑制作用。PCA處理后RT4細胞的p-AKT和p-STAT3蛋白水平顯著降低；過表達CXCR7可致膀胱癌RT4細胞細胞的p-AKT和p-STAT3蛋白水平顯著升高，說明PCA可抑制膀胱癌細胞生長、遷移和侵襲，而過表達CXCR7可逆轉PCA對膀胱癌細胞生長、遷移和侵襲的抑制作用，其機制可能與AKT和STAT3信號通路有關。本實驗的研究成果可為膀胱癌的預防和治療提供新的思路和實驗依據(jù)。

Figure 6.The effects of CXCR7 over-expression and procaine（PCA）on the protein levels of AKT/STAT3 signaling pathway-related molecules in the RT4 cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs PBS group；#P＜0.05 vs PCA+pcDNA group.圖6 過表達CXCR7和普魯卡因對RT4細胞AKT/STAT3信號通路相關分子蛋白水平的影響