羅立慧 ，傅曉瑩 ，鄭揚希 ，梁偉杰 ，智喜梅 ，鄧海鷗，張偉杰，王瑞雪，吳 文△

（1南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510515；2廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所東病區(qū)內(nèi)分泌科，廣東廣州510080；3汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東汕頭515063）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）合并骨質(zhì)疏松癥（diabetic osteoporosis，DOP）是指長期血糖升高引起的骨骼基質(zhì)層破壞、骨密度降低、骨折風(fēng)險升高的一種骨病，其發(fā)病率高、治療措施有限，是DM嚴重的并發(fā)癥之一，已成為當前國際上有關(guān)糖尿病并發(fā)癥研究的熱點之一［1］。迄今，DOP骨代謝異常的作用機制尚未完全闡明，其中成骨細胞（osteoblast，OB）功能障礙處于骨代謝異常的核心環(huán)節(jié)［2-3］。因此，深入探討高血糖對OB的損傷作用及其機制具有重要的臨床意義。

近年來，DM被認為是一種慢性免疫炎癥性疾病，特別是其并發(fā)癥與慢性炎癥有密切的關(guān)系［4］。細胞焦亡（pyroptosis），也被稱為“細胞炎性壞死”，是一種和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的程序性細胞死亡方式。細胞焦亡這一術(shù)語由Brennan和Cooksen在2000年提出［5］，并于2012年被國際細胞死亡命名委員會定義為胱天蛋白酶1（caspase-1，CASP1）依賴性程序性細胞死亡［6］。焦亡發(fā)生過程中所產(chǎn)生的炎癥小體（inflammasome）是由胞漿內(nèi)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）等模式識別受體及胱天蛋白酶1前體（procaspase-1）經(jīng)含胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）銜接而組裝形成的大分子復(fù)合物。炎癥小體能識別細菌、病毒等感染性或非感染性危險信號分子，將非活性的procaspase-1聚集；procaspase-1則自發(fā)解構(gòu)形成兩類亞基（p20和p10），2個p20亞基和2個p10亞基組裝成四聚體并激活CASP1，進而促進白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18等炎癥細胞因子大量釋放，引起“瀑布效應(yīng)”［7］。細胞焦亡與DM及其并發(fā)癥關(guān)系密切，其中在DM相關(guān)心血管損害中的作用研究頗多。Qiu等［8］指出，高糖（high glucose，HG）激活NLRP3炎癥小體后能通過細胞焦亡途徑加重DM大鼠的心肌缺血/再灌注損傷，同時采用CASP1抑制劑可減輕心肌細胞損傷；Luo［9］等報道，在2型 DM大鼠在體或離體模型中均可見NLRP3、procaspase-1、CASP1和IL-1β表達的增加，但是，沉默NLRP3基因可抑制糖尿病心肌病的發(fā)展。此外，亦有研究表明，焦亡能夠介導(dǎo)DM引起的慢性腎小球疾?。?0］及視網(wǎng)膜病變［11］。然而，細胞焦亡是否參與HG引起的骨代謝紊亂，至今鮮有報道。為此，本研究建立HG損傷MC3T3-E1細胞（小鼠胚胎成骨細胞）模型，旨在探討細胞焦亡是否參與HG引起的成骨細胞炎癥和損傷。

材料和方法

1 材料

針對CASP1基因的小干擾RNA（CASP1-siRNA）由廣州銳博生物公司設(shè)計合成；地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉、羅丹明123（rhodamine 123，Rh123）及 2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酯（2′，7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）購于 Sigma-Aldrich；抗NLRP3抗體和抗CASP1抗體購自Abcam公司；細胞計數(shù)試劑盒 8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）購于上海貝博生物科技有限公司；IL-18和IL-1β ELISA試劑盒由武漢華美生物工程有限公司提供；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；茜素紅染色試劑盒購自索萊寶科技有限公司；特級胎牛血清和α-MEM培養(yǎng)基購自Gibco BRL；MC3T3-E1細胞由上海中科院細胞庫提供。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) MC3T3-E1細胞為小鼠胚胎成骨細胞，來源于顱頂骨，培養(yǎng)于含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基，置于 5%CO2、濕度 70%～80%、溫度37℃的細胞培養(yǎng)箱中培育。當細胞密度達80%左右時，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA進行消化，根據(jù)消化情況迅速加入完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹落瓶壁細胞并吸出細胞懸液，在1 000 r/min條件下離心5 min，按1∶3～1∶5的比例進行傳代及后續(xù)實驗。

2.2 實驗分組 實驗分為4組：（1）對照（control）組：α-MEM培養(yǎng)基（葡萄糖濃度為5.5 mmol/L）處理MC3T3-E1細胞24 h；（2）HG組：用高糖培養(yǎng)基（葡萄糖濃度為45 mmol/L）處理細胞24 h；（3）CASP1-siRNA+HG組：50 nmol/L CASP1-siRNA轉(zhuǎn)染細胞6 h后撤去，PBS沖洗后更換為高糖培養(yǎng)基繼續(xù)處理細胞24 h；（4）陰性對照（negative control，NC）siRNA+HG組：50 nmol/L NC siRNA轉(zhuǎn)染細胞6 h后撤去，PBS沖洗后更換為高糖培養(yǎng)基處理細胞24 h。

2.3 CASP1-siRNA細胞轉(zhuǎn)染和最佳干擾序列的篩選 由廣州銳博生物公司設(shè)計并提供3條CASP1-siRNA序列（001：5′-GAAGGCCCATATAGAGAAA-3′；002：5′-CCAAGGTGATCATTATTCA-3′；003：5′-GCTGAAACATTTGTTGTCA-3′）和1條NC siRNA序列。用RNase-free water溶解siRNA凍干粉并配制成20 μmol/L的儲存液，在細胞密度達30%～50%實施轉(zhuǎn)染，按說明書要求稀釋siRNA及加入riboFECTTMCP Reagent制備成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，使轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/L，室溫孵育10 min后進行轉(zhuǎn)染操作，6 h后按實驗分組要求進行相應(yīng)的干預(yù)措施。轉(zhuǎn)染效果評估通過Western blot法檢測CASP1的表達來進行，選取沉默效果最佳的一個序列用于后續(xù)的實驗。實驗重復(fù)3次。

2.4 成骨細胞誘導(dǎo)分化 待細胞生長融合約80%時，根據(jù)實驗分組要求處理后更換成骨誘導(dǎo)分化液繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液1次，其中誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基由含4%胎牛血清、10 nmol/L地塞米松、50 mg/L維生素C及10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的α-MEM培養(yǎng)基配制而成。

2.5 CCK-8法測定細胞存活率 接種MC3T3-E1細胞于96孔板，當細胞密度達到80%時，給予不同干預(yù)后，根據(jù)CCK-8試劑盒說明書要求，先棄去細胞培養(yǎng)液，于每孔加入 90 μL α-MEM和10 μL CCK-8試劑，37℃溫箱中孵育2～4 h，設(shè)定酶標儀波長為450 nm，輕輕振動5 s，記錄各孔吸光度（A），并計算各組重復(fù)孔平均值，代入公式：細胞相對活力（%）=處理組A/對照組A×100%。實驗重復(fù)3次。

2.6 Western blot法檢測NLRP3和CASP1蛋白表達水平 接種MC3T3-E1細胞于6孔板中，密度達80%后根據(jù)實驗分組予相應(yīng)處理后吸出培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS沖洗 3次，每孔加入裂解液 30～40 μL，于冰上靜置裂解30 min，細胞刮刀充分刮取蛋白，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清并采用BCA法計算蛋白濃度。各組蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉60 min，隨后分別加入抗NLRP3抗體和抗CASP1抗體（均1∶1 000稀釋），4℃搖床孵育過夜，冷TBST漂洗3次，每次5 min，加入相應(yīng)的II抗（1∶2 500稀釋）4℃搖床孵育2 h，再予TBST漂洗3次，每次5 min，在PVDF膜上加入發(fā)光試劑ECL顯色，暗室曝光，最后凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。實驗重復(fù)3次。

2.7 ELISA法檢測IL-18和IL-1β水平 收集各組細胞培養(yǎng)上清液作為待測標本，按照ELISA試劑盒操作說明書步驟，往包被抗IL-18和IL-1β抗體的微孔板中分別加入待測標本，最終每孔加入終止溶液終止反應(yīng)，5 min內(nèi)用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（A），計算各組重復(fù)孔平均值，代入公式：IL-18和IL-1β的釋放率（%）=處理組A/對照組A×100%。實驗重復(fù)3次。

2.8 DCFH-DA染色熒光顯微鏡照相法檢測細胞內(nèi)ROS水平 將MC3T3-E1細胞傳代接種于24孔板，經(jīng)干預(yù)處理后，PBS液沖洗3次，每孔加入濃度為10 μmol/L的DCFH-DA熒光液200 μL，溫箱中孵育30 min，繼續(xù)PBS沖洗吸干，倒置熒光顯微鏡每個分組隨機拍攝3個高倍鏡視野，ImageJ 1.47i軟件記錄每張照片綠色熒光強度的平均值［即平均熒光強度（mean fluorescent intensity，MFI）］并進行統(tǒng)計分析。實驗重復(fù)3次。

2.9 Rh123染色熒光顯微鏡測定成骨細胞線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP） 24孔板培育MC3T3-E1細胞，細胞融合約80%時干預(yù)細胞后予PBS潤洗3次，每孔加入含1 mg/L Rh123染色劑的無血清培養(yǎng)基200 μL，37℃培養(yǎng)箱中溫育45 min，隨后顯微鏡下隨機攝片，最后應(yīng)用圖像分析軟件計算MFI（反映MMP高低），并統(tǒng)計分析各組數(shù)據(jù)。實驗重復(fù)3次。

2.10 ALP活性測定 將MC3T3-E1細胞傳代接種于6孔板中，按照不同實驗分組予相應(yīng)干預(yù)后，更換成骨誘導(dǎo)分化液培養(yǎng)7 d，吸去培養(yǎng)基，每孔加入適量裂解液充分裂解60 min，4℃、15 000 r/min離心15 min，上清液作為待測樣本，遵循ALP微板法測定試劑盒步驟添加試劑，在酶標儀波長520 nm下測定各孔吸光度（A），根據(jù)說明書提供的公式計算出細胞ALP活性。

2.11 茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色 MC3T3-E1細胞接種于6孔板中，按實驗組要求給予相應(yīng)的干預(yù)后更換成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，第21天時收集細胞，95%無水乙醇進行樣本固定，茜素紅染色試劑染色，PBS沖洗，隨后在倒置顯微鏡下觀察鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準誤（mean±SEM）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較運用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HG上調(diào)成骨細胞NLRP3和CASP1蛋白的表達

HG作用于成骨細胞24 h，從6 h開始，與control組相比，NLRP3和CASP1蛋白表達水平分別升高，見圖1（P＜0.01），其中HG作用細胞24 h時，上述蛋白表達水平升高最明顯（P＜0.01）。

2 CASP1-siRNA最佳干擾序列的篩選

Western blot結(jié)果顯示，與control組比較，CASP1-siRNA 001和003均能顯著下調(diào)CASP1蛋白的表達（P＜0.01），其中003組CASP1的蛋白表達水平下調(diào)了76%，下降程度最為顯著，故選取CASP1-siRNA 003用于后續(xù)的實驗。CASP1-siRNA 002和NC siRNA對CASP1的蛋白表達無明顯影響，見圖2。

Figure 2.Screening of the most effective CASP1-siRNA in MC3T3-E1 osteoblasts.Mean±SEM.n=3.**P＜0.01 vs control group.圖2 CASP1-siRNA最佳干擾序列的篩選

3 沉默CASP1基因抑制HG對成骨細胞的毒性

為了觀察HG對MC3T3-E1成骨細胞活力的影響，我們分別進行量-效及時-效關(guān)系的研究。首先以不同濃度（25、35、45和55 mmol/L）的葡萄糖對細胞作用24 h，觀察其對細胞活力的影響，結(jié)果顯示，與control組相比，上述濃度葡萄糖均有明顯的細胞毒性，使細胞活力下降（P＜0.01），其中葡萄糖濃度為45和55 mmol/L時細胞毒性最明顯，細胞相對活力均下降均接近50%，且兩者之間無明顯差異，因此我們選定45 mmol/L作為葡萄糖損傷細胞的濃度，見3A；然后用45 mmol/L葡萄糖處理細胞不同時間（0、6、12和24 h），結(jié)果顯示，隨著葡萄糖干預(yù)時間的延長，細胞活力顯著降低，并且呈明顯的時間依賴關(guān)系（P＜0.01），24 h時的細胞相對活力下降到（57.03±1.36）%，見圖3B。根據(jù)上述結(jié)果，我們選定45 mmol/L葡萄糖干預(yù)MC3T3-E1細胞24 h來構(gòu)建HG損傷成骨細胞模型。

與control組相比，HG處理MC3T3-E1細胞24 h，可使細胞活力明顯下降（P＜0.01）；與HG組比較，CASP1-siRNA轉(zhuǎn)染細胞6 h能減輕HG的細胞毒性，使細胞活力顯著升高（P＜0.01）；NC siRNA對HG降低成骨細胞活力的作用無明顯影響，見圖3C。

Figure 3.Knockdown of CASP1 expression inhibited the cytotoxicity of high glucose（HG）on MC3T3-E1 osteoblasts.The cell viability was detected by CCK-8 assay.A：dose-dependent effect of HG；B：time-dependent effect of HG；C：the effect of CASP1-siRNA on the viability of the cells treated with HG.Mean±SEM.n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs HG group.圖3 沉默CASP1基因抑制HG對成骨細胞的毒性

4 沉默CASP1基因減少HG引起的成骨細胞炎癥因子分泌

與control組相比，HG作用成骨細胞24 h能促進IL-18及IL-1β的分泌（P＜0.01）；應(yīng)用CASP1-siRNA轉(zhuǎn)染細胞6 h后再予HG作用24 h，IL-18及IL-1β的分泌明顯減少，與HG組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；NC siRNA對HG促進IL-18和IL-1β分泌的作用無明顯影響，見圖4。

Figure 4.Knockdown of CASP1 expression inhibited high glucose（HG）-induced secretion of IL-18（A）and IL-1β（B） in MC3T3-E1 osteoblasts.Mean±SEM.n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs HG group.圖4 沉默CASP1基因減少HG引起的成骨細胞IL-18和IL-1β分泌

5 沉默CASP1基因抑制HG引起的成骨細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)

與control組比較，HG作用成骨細胞24 h可引起明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致胞內(nèi)ROS堆積，MFI明顯升高（P＜0.01）；與HG組比較，以50 nmol/L CASP1-siRNA轉(zhuǎn)染細胞6 h后再用HG處理24 h，能顯著減少細胞內(nèi)ROS的堆積，MFI明顯降低（P＜0.01）；NC siRNA對HG促進成骨細胞內(nèi)ROS生成的作用無明顯影響，見圖5。

Figure 5.Knockdown of CASP1 expression inhibited high glucose（HG）-induced accumulation of intracellular reactive oxygen species（ROS）in MC3T3-E1 osteoblasts（×40）.Mean±SEM.n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs HG group.圖5 沉默CASP1基因抑制HG引起的MC3T3-E1成骨細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)

6 沉默CASP1基因抑制HG引起的MMP丟失

HG干預(yù)24 h可使成骨細胞內(nèi)Rh123的MFI值從（27.63±0.37）%（control組）降低至（10.33±0.88）%（P＜0.01）；CASP1-siRNA能夠減少成骨細胞MMP丟失，使MFI上升至（24.54±0.30）%，與HG組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；NC siRNA處理對HG引起的MMP丟失無明顯影響，見圖6。

7 沉默CASP1基因減輕HG對ALP活性的抑制

與control組比較，HG作用MC3T3-E1細胞24 h可使ALP活性明顯下降（P＜0.01）；CASP1-siRNA轉(zhuǎn)染可對抗HG對ALP活性的抑制作用（P＜0.01），使ALP活性升高，與HG組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；NC siRNA干預(yù)對HG抑制ALP活性的作用無明顯影響，見圖7。

Figure 6.Knockdown of CASP1 expression inhibited HG-induced loss of mitochondrial membrane potential（MMP） in MC3T3-E1 osteoblasts（×40）.Mean±SEM.n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs HG group.圖6 沉默CASP1基因抑制HG引起MC3T3-E1成骨細胞的MMP丟失

8 沉默CASP1基因可對抗HG引起的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量減少

成骨細胞培養(yǎng)至21 d時，經(jīng)茜素紅染色后鏡下可見橙紅色的礦化結(jié)節(jié)；HG作用細胞24 h可明顯減少礦化結(jié)節(jié)的形成，與control組比較有顯著差異（P＜0.01）；沉默CASP1表達可減弱HG對礦化結(jié)節(jié)形成的抑制作用，與HG組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；NC siRNA對HG減少礦化結(jié)節(jié)生成的作用無明顯影響，見圖8。

討 論

迄今已有實驗證實，自噬（autophagy）、凋亡（apoptosis）、壞死性凋亡（necroptosis）等多種細胞死亡方式參與DOP的發(fā)生和發(fā)展［12-14］。焦亡作為一種新近發(fā)現(xiàn)的細胞死亡方式，在DM導(dǎo)致多器官損傷如糖尿病心肌病、糖尿病腎病和糖尿病視網(wǎng)膜病變中起著重要作用［8-11］，但焦亡是否參與DOP的發(fā)生，目前尚未見報道。

Figure 7.Knockdown of CASP1 expression inhibited HG-induced reduction of ALP activity in MC3T3-E1 osteoblasts.Mean±SEM.n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs HG group.圖7 沉默CASP1基因減輕HG對成骨細胞ALP活性的抑制

現(xiàn)已明確，OB功能障礙是骨代謝異常的核心環(huán)節(jié)［2-3］。高血糖可通過多種病理生理機制，例如氧化應(yīng)激與鈣超載［15］、炎癥及 PI3K/AKT 信號通路［12，16］等損傷OB或引起骨質(zhì)壞死［17-18］。本研究在HG損傷小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1的實驗?zāi)Ｐ鸵沧C實，HG對OB損傷是多方面的，除了能引起明顯的細胞炎癥反應(yīng)外，還可使細胞存活率、ALP活性和礦化能力下降，ROS生成和MMP丟失增多等，這與郭寶磊［16］及Dong等［12］的報道相一致，表明這一細胞模型能較客觀地反映HG對MC3T3-E1成骨細胞的致炎癥與損傷作用，為深入研究HG對OB的損傷及其機制提供了可靠的細胞實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

Figure 8.Knockdown of casepase-1 expression reduces the HG-induced the mineralization capability in MC3T3-E1 osteoblasts（×200）.Mean±SEM.n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs the HG group.圖8 沉默CASP1基因可對抗HG引起的MC3T3-E1成骨細胞礦化結(jié)節(jié)數(shù)量減少

值得注意的是，在本研究中，我們觀察到：HG作用MC3T3-E1細胞可呈時間依賴性趨勢上調(diào)NLRP3和CASP1蛋白表達水平，且能促進其下游炎癥因子如IL-18和IL-1β的釋放，這與Qiu等［8］與Luo等［9］在DM大鼠心肌細胞模型的研究結(jié)果相類似，并清晰地提示：在HG損傷OB過程中，可能存在細胞焦亡這一現(xiàn)象。于是，我們采用CASP1-siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)，進一步觀察特異性沉默CASP1的表達對HG損傷OB的影響。實驗結(jié)果表明，沉默CASP1基因表達具有明顯的OB保護作用，能抑制HG對MC3T3-E1細胞的致炎癥及損傷作用，表現(xiàn)為細胞活力和ALP活性增高，礦化能力恢復(fù)，IL-18和IL-1β分泌、ROS生成及MMP丟失減少，這進一步證實焦亡參與HG引起的OB炎癥和損傷。此外，Li等［17］發(fā)現(xiàn)，在DM大鼠模型中，抑制NLRP3炎性體分泌，可下調(diào)ASC、procaspase-1、IL-1β表達從而促進牙槽骨損傷修復(fù)；Zhang等［18］亦指出，雙膦酸鹽通過NLRP3/caspase-1/IL-1β機制誘導(dǎo)DM小鼠發(fā)生下頜骨壞死。以上研究支持本文的實驗結(jié)果。

另外，由于血糖水平的高低與體內(nèi)胰島素缺乏和（或）胰島素抵抗水平密切相關(guān)，因此，在探討焦亡在高糖引起成骨細胞炎癥與損傷中的作用時，亦應(yīng)考慮胰島素水平在其中的作用。有研究指出，胰島素能刺激成骨細胞分化并導(dǎo)致骨鈣素（osteocalcin）生成增多，骨鈣素能促進胰島β細胞增殖，提高骨骼肌對胰島素的敏感性［19］。Gower等［20］報道，2型糖尿病的骨鈣素水平降低。鑒于胰島素對成骨細胞分化的作用，今后，本研究擬在2型糖尿病大鼠模型進一步探討胰島素對焦亡損傷成骨細胞及炎癥反應(yīng)的影響。

綜上所述，本研究證實，焦亡介導(dǎo)HG誘導(dǎo)的小鼠胚胎成骨細胞炎癥和損傷，進一步揭示DOP新的病理生理機制，并為防治DOP開拓了新思路。