張珂珂，李紅梅△，劉 暢

（1暨南大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理生理學系國家中醫(yī)藥管理局重點實驗室，廣東廣州510632；2大連市中心醫(yī)院中心實驗室，遼寧大連116033）

肌腱損傷的修復和重建是骨科醫(yī)生面臨的一大挑戰(zhàn)。肌腱組織血液供應差，自我修復能力有限，因此，受損肌腱組織愈合非常緩慢，即使愈合也很難達到正常肌腱的完整結(jié)構(gòu)和機械強度［1］。目前用于受損肌腱修復的治療方法有自體移植物、異體移植物、合成和天然細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）來源的移植物等，成功率極低，且具有傳播疾病或產(chǎn)生免疫排斥反應的風險。因此，尋找有效的肌腱組織修復材料依然是臨床面臨的重大難題［2］。

近年來，去細胞肌腱組織由于具有巨大的臨床應用潛力而備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，去細胞多層肌腱切片支架可誘導骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）分化為肌腱細胞［3］，且天然肌腱ECM支架能增強受損肌腱的承重能力［4］。Tong等［5］利用牛跟腱作為支架，進一步研究發(fā)現(xiàn)膠原纖維的方向而非膠原蛋白的含量影響B(tài)MSCs排列、延伸和分化。Yiu等［6］利用納米纖維模擬肌腱組織的膠原纖維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)有序排列的納米纖維可以促進干細胞向肌腱分化，而隨機排列的納米纖維則促進干細胞向成骨細胞分化。我們前期利用大鼠尾肌腱制備了膠原纖維定向排列的肌腱ECM支架（定向肌腱ECM支架），發(fā)現(xiàn)膠原纖維的有序結(jié)構(gòu)能誘導BMSCs沿膠原纖維定向生長，并促進BMSCs向肌腱細胞分化，然而隨機排列的膠原纖維支架對BMSCs分化的影響尚不清楚。在本研究中，我們通過打亂鼠尾肌腱膠原纖維固有的排列，制備出膠原纖維隨機排列的肌腱ECM支架（隨機肌腱ECM支架），在此基礎(chǔ)上進一步探究隨機肌腱ECM支架對BMSCs活力和分化的影響。

材料和方法

1 材料

SPF級雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠，4～6周齡，160～180 g，購自廣東醫(yī)學實驗動物中心，許可證號為SCXK（粵）2013-0020。LG-DMEM培養(yǎng)基、澳洲胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、PBS緩沖液、0.25%胰酶（trypsin）均購自HyClone；青霉素/鏈霉素（雙抗）購自Gibco公司；流式檢測抗體（小鼠抗人CD44-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC和CD106-PE）購自 BioLegend；4%多聚甲醛固定液、DAPI、Triton X-100、DNA酶（DNase）和RNA酶（RNase）均購自Sigma；戊巴比妥鈉購自北京諾特萊斯生物科技有限公司；細胞計數(shù)試劑盒8（Cell Counting Kit-8，CCK8）購自Dojindo；DNA提取試劑盒購自天根生物科技有限公司；Live/Dead試劑盒購自Life Technologies；RNA提取試劑盒（RNeasy Plus Mini Kit）購自Qiagen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT Kit）和real-time PCR試劑盒（SYBR Premix Ex Taq Kit）購自TaKaRa；所用引物由Invitrogen公司設(shè)計合成。

2 方法

2.1 大鼠BMSCs的提取 采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)BMSCs。SD大鼠3%戊巴比妥鈉麻醉后，小心分離股骨和脛骨，75%乙醇浸泡消毒，PBS清洗2～3次。使用含10%FBS和1%雙抗的LG-DMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，獲取原代BMSCs，接種于細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于細胞培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中，每隔48 h換液，棄去未貼壁細胞。待細胞融合度達80%以上時，1∶3傳代培養(yǎng)。

2.2 大鼠BMSCs的鑒定 利用流式細胞術(shù)檢測干細胞表面標志物：取融合率達80%以上的第2代BMSCs，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗，0.25%胰酶消化后制備成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×109/L，裝入流式管；每管中加入500 μL細胞懸液，依次將CD44（1∶1 000）、CD45（1∶8 000）、CD90（1∶1 000）、CD106（1∶1 000）抗體稀釋到相應比例后加入到細胞懸液中，吹打均勻，4℃避光孵育30 min；PBS清洗3次，棄去上清，加入500 μL PBS重懸細胞后，避光使用流式細胞術(shù)檢測，計算細胞表面抗原表達率。

2.3 隨機肌腱ECM支架的制備方法

2.3.1 天然肌腱組織的提取和脫細胞處理 對大鼠實施安樂死后，收集其尾巴，去除尾巴外包圍的皮膚組織，使尾肌腱組織內(nèi)的膠原蛋白纖維暴露出來；小心去除與膠原蛋白黏附的肌肉、脂肪等組織；收集大鼠尾肌腱膠原蛋白，PBS清洗3次。收集的鼠尾肌腱即為天然肌腱組織（normal）。脫細胞肌腱組織（decellularized）經(jīng)以下處理：1%Triton X-100靜置處理48小時，PBS洗滌3次，每次30 min；再用含400 μg/L DNase和200 μg/L RNase的混合液處理 24 h，37℃水平震蕩，60 Hz，PBS洗滌3次，每次30 min。利用HE染色檢測組織內(nèi)細胞核殘余情況，利用試劑盒分別提取天然組織和脫細胞組織內(nèi)DNA，紫外分光光度計測量DNA濃度，并計算每g組織內(nèi)的DNA含量（μg），以μg/g為單位表示。

2.3.2 隨機肌腱ECM支架的制備 將脫細胞肌腱組織縱向切成長度約5 cm的片段后，放入含有5顆研磨珠的2 mL離心管，置于液氮中30 s，然后用組織勻漿機研磨90 s（60 Hz）；經(jīng)此步驟后，肌腱呈絮狀；將絮狀肌腱基質(zhì)均勻平鋪在載玻片上，室溫下晾干后收集；使用前，修剪成1.5 cm×1.5 cm大小。利用體視顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察支架表面結(jié)構(gòu)。其他樣品經(jīng)伽馬射線滅菌后，無菌密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 BMSCs在隨機肌腱ECM支架上的活力檢測

2.4.1 Live/Dead染色 支架于生物安全柜中用無菌水浸泡過夜，風干0.5 h。以4×103/cm2的密度將BMSCs種植在支架上，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3 h。待細胞充分粘附在支架上后，沿壁緩慢補加3 mL培養(yǎng)基，每48 h更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)1、3、7和14 d后，將支架小心轉(zhuǎn)移至新的24孔板中，PBS小心清洗；加入2 mL Live/Dead染色工作液，覆蓋支架表面，于37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，PBS清洗2次，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察細胞活力和形態(tài)。

2.4.2 CCK8法檢測細胞活力 將BMSCs按上述方法分別接種在24孔板（對照組，control group）和隨機肌腱ECM支架（實驗組，random group）上，每孔板和支架上的接種細胞數(shù)為9 000個。培養(yǎng)1、3和7 d時，每孔加入2 mL含10%（體積分數(shù)）CCK8的完全培養(yǎng)基，于37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，然后吸取200 μL孵育液，加入96孔板中，用酶標儀在450 nm波長下檢測各孔吸光度（A）。

2.5 RT-qPCR檢測 將BMSCs以1×105/cm2的密度種植在不含支架的24孔板（對照組，control group）和隨機肌腱ECM支架上（實驗組，random group）上。培養(yǎng)14 d后，將隨機ECM支架轉(zhuǎn)移至新的24孔板中，PBS清洗2次；加入2 mL胰酶，37℃下消化5 min，鏡下觀察到有脫落的圓形細胞時，加入6 mL培養(yǎng)基中和，然后利用培養(yǎng)基清洗支架3次，收集所有液體；2 000 r/min離心5 min，去上清；使用RNeasy Plus Mini Kit提取BMSCs總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用real-time PCR技術(shù)檢測肌腱標志物I型膠原蛋白（collagen type I，Col I）、肌腱特異轉(zhuǎn)錄因子scleraxis（SCX）及成骨標志物堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）的mRNA表達水平。所用引物序列如表1所示。GAPDH作為內(nèi)參照，通過2-ΔΔCt法計算各組mRNA的表達量。

表1 RT-qPCR實驗的引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 14.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，兩組間均數(shù)比較使用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 BMSCs的鑒定

原代BMSCs培養(yǎng)至第4天時在倒置相差顯微鏡下進行觀察，細胞呈紡錘形，貼壁生長，并逐漸形成均一群落，見圖1A，與文獻報道BMSCs形態(tài)一致［4］。流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示，第2代BMCSs中間充質(zhì)細胞標志物CD44和成纖維細胞標志物CD90表達率分別為95.6%和99.5%，均大于95%；淋巴細胞標志物CD45和內(nèi)皮細胞標志物CD106表達率分別為3.25%和2.32%，均小于5%，見圖1B，證明分離純化的細胞是BMSCs。

2 肌腱組織脫細胞處理

HE染色結(jié)果顯示，經(jīng)過1%Triton X-100和DNase/RNase脫細胞處理后，肌腱組織內(nèi)細胞核顯著減少，見圖1A。此外，與天然肌腱組織（normal）相比，脫細胞處理組（decellularized）肌腱組織的DNA含量顯著降低（P＜0.05），從（481.7±15.8）μg/g顯著降至（31.0±3.8）μg/g，見圖2B。

Figure 1.The morphological observation and stemness identification of the BMSCs.A：the morphological observation of the BMSCs at passage 0（scale bar=100 μm）；B：flow cytometric analysis of the expression of mesenchymalstem cell marker CD44，fibroblast marker CD90，leukocyte marker CD45 and endothelial cell marker CD106 on BMSCs.圖1 BMSCs形態(tài)觀察及干性鑒定

Figure 2.Decellularization of rat tail tendons.A：HE staining of normal tendons and decellularized tendons（scale bar=50 μm）；B：cell DNA content in normal tendons and decellularized tendons.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs normal group.圖2 肌腱組織脫細胞

3 隨機肌腱ECM支架的表面結(jié)構(gòu)表征

隨機肌腱ECM支架的制備過程如圖3A所示，其外觀圖和表面結(jié)構(gòu)如圖3B所示，材料表面結(jié)構(gòu)均勻，且觀察不到原有膠原纖維的有序結(jié)構(gòu)，膠原纖維呈無序排布。

4 BMSCs在隨機肌腱ECM支架上活力增強

Live/Dead染液將活細胞標記為綠色，死細胞標記為紅色。BMSCs在隨機肌腱ECM支架上培養(yǎng)1、3、7和14 d后，均未在支架表面檢測到死細胞；隨著培養(yǎng)時間延長，隨機肌腱ECM支架表面BMSCs數(shù)目逐漸增多，呈多邊形，細胞之間聯(lián)系密切；第14天，BMSCs充滿整個支架表面，見圖4A。CCK8結(jié)果進一步證實，與對照組相比，培養(yǎng)第7天BMSCs在隨機肌腱ECM支架上的活力顯著增強（P＜0.05），見圖4B。

5 BMSCs在隨機肌腱ECM支架上向成骨細胞分化

Figure 3.Preparation of random tendon ECM scaffolds（A）and their appearance，stereomicroscopic image（scale bar=100 μm）and SEM image（B）.圖3 隨機肌腱ECM支架的制備和表面結(jié)構(gòu)觀察

Figure 4.The viability of the BMSCs.A：BMSCs seeded on the random tendon ECM scaffolds at day 1，day 3，day 7 and day 14 were observed by fluorescence microscopy，with live cells stained green and dead cells stained red；B：the viability of the BMSCs at day 1，day 3 and day 7 was measured by CCK8 assay.Control：BMSCs seeded on the culture plate；random：BMSCs seeded on random tendon ECM scaffolds.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group.圖4 BMSCs在隨機肌腱ECM支架上的活力增強

與單獨在24孔板中培養(yǎng)的BMSCs對照（control）組相比，BMSCs在隨機肌腱ECM支架（random）上培養(yǎng)14 d后，肌腱細胞標志物Col I和SCX的表達量顯著下調(diào)（P＜0.05），而成骨標志物ALP和RUNX2在隨機肌腱ECM支架上的表達量顯著上調(diào)（P＜0.05），見圖5。

討 論

脫細胞天然肌腱組織，被認為是肌腱組織工程的理想支架材料，在肌腱組織工程和再生醫(yī)學領(lǐng)域受到廣泛重視［7］。目前常用的動物肌腱組織取自兔、牛等，材料獲取周期長。而大鼠來源充足，個體間差異較小，且尾肌腱材質(zhì)均一，取材簡單，可有效提高實驗效率。因此，本研究利用大鼠尾肌腱ECM作為基質(zhì)微環(huán)境，研究膠原纖維排列方式對BMSCs分化的影響，希望為修復肌腱損傷的組織工程提供所需生物材料。

Figure 5.Differentiation of BMSCs at day 14.Relative mRNA expression levels of tenocyte-related markers collagen type I（Col I）and scleraxis（SCX），and osteogenic markers alkaline phosphatase（ALP）and Runt-related transcription factor 2（RUNX2）were detected by RT-qPCR.Control：BMSCs seeded on the culture plate；random：BMSCs seeded on random tendon ECM scaffolds.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group.圖5 BMSCs在隨機肌腱ECM支架上向成骨細胞分化

在應用來源于動物的肌腱組織作為支架材料時，首先要進行脫細胞處理，以去除組織原本的細胞和表面抗原，降低免疫原性，但要保持其ECM結(jié)構(gòu)、組成及固有的生物力學特性，以保證肌腱ECM再細胞化后用于肌腱重建效果良好［8］。物理法、化學試劑處理法和生物試劑處理法是最常見的脫細胞方法。十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）和Triton X-100被廣泛用于脫細胞處理［9］，其中SDS脫細胞能力強，但對組織損傷也較嚴重；Triton X-100較為溫和，但脫細胞效果不如SDS。使用這些化學物質(zhì)時，對于不同的組織，其使用濃度、處理時間以及其他物理或化學參數(shù)都要相應地發(fā)生變化，很難設(shè)定標準實驗方案。在本研究中，大鼠尾肌腱組織經(jīng)1%Triton X-100處理48 h，DNase/RNase混合液處理24 h后，未觀察到殘余細胞核，組織內(nèi)殘留的DNA 含量小于 50 μg/g，符合脫細胞標準［10］，同時又保留了天然肌腱的物理結(jié)構(gòu)。

肌腱組織ECM的組成和膠原纖維排列方式為細胞接種、黏附、增殖和分化提供了理想的微環(huán)境［11］。文獻報道，經(jīng)脫細胞處理后，肌腱ECM中的蛋白聚糖（纖維調(diào)節(jié)蛋白、雙糖鏈蛋白聚糖）和生長因子（TGF-β1、IGF-1、VEGF和CTGF）能妥善保存在組織內(nèi)［12］。在本研究中，我們制備了膠原纖維隨機排列的肌腱ECM支架，發(fā)現(xiàn)種植在支架上的BMSCs能夠維持較高的細胞活力，這可能與脫細胞肌腱支架中保留的蛋白聚糖和少量生長因子有關(guān)。Zhang等［13］的研究也發(fā)現(xiàn)兔來源的肌腱干細胞在肌腱基質(zhì)上的增長速度比在塑料培養(yǎng)皿上更快，這與我們的研究結(jié)果一致。我們在前期研究中利用大鼠尾肌腱制備了肌腱膠原纖維定向排列的脫細胞肌腱ECM支架，發(fā)現(xiàn)種植在其上的BMSCs沿膠原纖維平行方向排列生長［14］；在本研究中，我們利用勻漿機研磨制備膠原纖維隨機排列的肌腱ECM支架，發(fā)現(xiàn)種植在其上的BMSCs排列雜亂，并非平行排列生長，這些結(jié)果均表明支架中膠原纖維的排列方式能夠影響種子細胞的排列和生物行為學。

肌腱ECM微環(huán)境的生物化學和生物物理信號，可以直接參與調(diào)控干細胞的生物學行為。據(jù)報道，纖維調(diào)節(jié)蛋白和雙糖鏈蛋白聚糖是構(gòu)成肌腱組織ECM的兩個關(guān)鍵成分，它們的缺失可能會導致種子細胞從成腱分化變?yōu)槌晒欠只?5］。此外，也有報道ECM微環(huán)境的表面形貌在調(diào)節(jié)干細胞行為中起重要作用［16］。另一個重要的微環(huán)境因素——基質(zhì)硬度已證明能決定干細胞命運。Engler等［17］發(fā)現(xiàn)，在模仿大腦組織的柔軟基質(zhì)上，MSCs開始顯示神經(jīng)元表型；在類似橫紋肌硬度的中等基質(zhì)上，干細胞發(fā)育成肌細胞譜系；在類似骨骼前體（類骨質(zhì)）的堅硬基質(zhì)上，干細胞分化為成骨細胞［18］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，定向肌腱ECM支架能促進BMSCs向肌腱細胞進行特異性分化［14］。而本研究發(fā)現(xiàn)，在隨機肌腱ECM支架上BMSCs肌腱細胞標志物Col I和SCX的表達顯著下調(diào)，而成骨細胞標志物ALP和RUNX2顯著上調(diào)，表明隨機肌腱ECM支架具有誘導BMSCs向成骨細胞分化的潛能。Liu等［10］發(fā)現(xiàn)定向肌腱ECM支架對干細胞成骨分化的誘導作用很弱；相反地，生長在隨機肌腱ECM支架上的BMSCs中Kdm6b和Jmjd1c的表達水平上調(diào)，表明隨機ECM支架的表面形貌可以調(diào)控表觀遺傳基因的表達，增強參與成骨分化信號傳導途徑的激活。綜上所述，隨機肌腱ECM支架和定向肌腱ECM支架對BMSCs分化的不同誘導作用可能與肌腱ECM的生化成分、基質(zhì)硬度、基質(zhì)表面形貌等因素有關(guān)，但這些因素對干細胞分化的調(diào)控機制尚需進一步研究。

本研究制備的膠原纖維隨機排列的肌腱ECM支架，能支持BMSCs黏附，增強BMSCs活力，并誘導BMSCs向成骨細胞分化，在韌帶/肌腱-骨連接的修復應用中具有重大潛能。