鄧 穎，王雪兒，張 琳

（南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，廣東廣州510515）

皮膚是人體面積最大的器官，由表皮和真皮構(gòu)成，以皮下組織與深層組織相連。表皮是皮膚的淺層，分為厚皮和薄皮。厚皮自下而上分為基底層、棘層、顆粒層、透明層和角質(zhì)層。角質(zhì)形成細(xì)胞（kerati-nocytes，KC）是皮膚表皮的主要構(gòu)成細(xì)胞，占表皮細(xì)胞的90%以上。表皮由基底層到角質(zhì)層的結(jié)構(gòu)變化反映了角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、遷移、分化等新陳代謝過程［1］。小鼠作為常用的皮膚發(fā)育和皮膚疾病動(dòng)物模型，在皮膚科學(xué)研究中發(fā)揮重要作用。小鼠背部皮膚與腹部皮膚占小鼠全身皮膚總面積的90%以上，因?yàn)樾∈蟊巢科つw具有完整的分層結(jié)構(gòu)，在生理以及解剖狀態(tài)更接近于人體皮膚，因此研究者們往往選用小鼠背部皮膚進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

然而，目前科學(xué)研究所使用的角質(zhì)形成細(xì)胞主要為人源性的細(xì)胞系和細(xì)胞株。2017年，Zhang等［2］嘗試?yán)眯∈笪膊科つw進(jìn)行了角質(zhì)形成細(xì)胞的分離培養(yǎng)。但是，小鼠背部皮膚與尾部皮膚在收縮能力、膠原以及表皮層數(shù)、毛囊分布、黑色素沉著等方面都存在著差異［3-4］。值得一提的是，目前關(guān)于皮膚創(chuàng)傷愈合、皮膚毛囊周期、皮膚光損傷及光老化等研究使用的小鼠皮膚模型幾乎均來自于成年小鼠背部皮膚［5-6］。然而，目前尚未見到良好的成年小鼠背部皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞分離方法。因此，構(gòu)建有效且高生長率的小鼠皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞，尤其是成年小鼠背部皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞原代分離培養(yǎng)方法尤為重要。

本研究首先利用4種方法分離成年小鼠背部皮膚表皮與真皮，探索成年小鼠表皮與真皮最適宜的分離條件；其次，分離表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，通過調(diào)整種板密度和種板方式，建立有效且高生長率的成年小鼠背部皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞原代分離培養(yǎng)方法；再次，對(duì)乳鼠皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和成年小鼠皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、集落形成效率與凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，探討二者生物學(xué)功能的差異。

材料和方法

1 動(dòng)物

由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（粵）2016-（1029）］提供出生1日的C57BL/6J乳鼠（P1 MICE）以及出生12周齡的健康雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠（12W MICE），飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，室內(nèi)溫度22～25℃，相對(duì)濕度為40%～60%，小鼠自由飲水飲食。

2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

胰蛋白酶消化液（含0.25%胰酶和0.02%EDTA）、75%乙醇、碘伏、DPBS 溶液（Gibco）；Dispase II（Sigma）；內(nèi)含生長因子、hydrocortisone、transferrin、epinephrine、GA-1000、BPE、rhEGF、insulin 的 KBMGOLD培養(yǎng)基（LONZA）；15 mL離心管、50 mL離心管、3 cm培養(yǎng)皿、48孔細(xì)胞培養(yǎng)板和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（NEST）；Cell-light EdU Apollo488（銳博生物）；CCK-8試劑（Bimake）；TUNEL Bright Red apoptosis detection kit（Vazyme）；結(jié)晶紫染色液（碧云天）。移液槍和無菌常用手術(shù)器械、細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo）；超凈工作臺(tái)（Airtech）；相差顯微鏡（Leica）；離心機(jī)（Sigma）；酶標(biāo)儀（Biotek）。

3 主要方法

3.1 成年小鼠背部皮膚表皮與真皮的分離 取同一只成年小鼠背部皮膚分為2 cm×2 cm的4個(gè)小塊，用4種不同消化分離方式分離表皮-真皮，具體方法如下：12周齡C57BL/6J小鼠，斷頸處死，經(jīng)脫毛處理后，分別置于75%乙醇、碘伏、75%乙醇中浸泡1 min，取成年小鼠整塊背部皮膚，修剪成約2 cm×2 cm正方形，徹底分離皮下組織、血管。含雙抗DPBS漂洗3次。表皮在上，真皮在下，平鋪置于3 cm小皿內(nèi)，分別采用如下所述4種方法進(jìn)行表皮-真皮消化分離：（1）中性蛋白酶消化法：沿組織邊緣加入1.5 mL自配中性蛋白酶，4℃消化22 h；（2）胰蛋白酶消化法：沿組織邊緣加入1.5 mL 0.25%胰蛋白酶，4℃消化22 h；（3）中性蛋白酶+胰蛋白酶聯(lián)合消化法：沿組織邊緣加入750 μL自配中性蛋白酶與750 μL 0.25%胰蛋白酶，4℃消化22 h；（4）中性蛋白酶+胰蛋白酶二步消化法：沿組織邊緣加入1.5 mL自配中性蛋白酶，4℃消化22 h。觀察到皮膚表面浮起，使消化酶沒過真皮，盡量保持表皮干燥。消化后，分離表皮，剪碎，加入200 μL 0.25%胰蛋白酶消化2 min，用胰酶抑制劑終止消化。

3.2 乳鼠背部皮膚表皮與真皮的分離 出生1日的C57BL/6J乳鼠在斷頸后用75%酒精消毒2次，移入超凈工作臺(tái)內(nèi)，PBS泡洗去除小鼠皮膚表面殘余酒精，取乳鼠背部皮膚。將其修剪成約2 cm×2 cm正方形，平鋪置于3 cm小皿內(nèi)，以中性蛋白酶消化法進(jìn)行表皮-真皮分離。

3.3 角質(zhì)形成細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng) 取消化后的皮膚，在含有消化酶的小皿內(nèi)分離表皮與真皮。取表皮組織置于一3 cm小皿內(nèi)，漂洗（為避免漂洗液的不同造成的后續(xù)結(jié)果差異，所有分組均采用胰酶抑制劑漂洗），剪碎，懸液過濾，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用含0.06 mmol/L Ca2+的KBM培養(yǎng)基吹打，制成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)皿上，0.5 h后補(bǔ)液。24 h后，換用含0.03 mmol/L Ca2+的KBM培養(yǎng)基。

3.4 角質(zhì)形成細(xì)胞的鑒定 細(xì)胞固定、封閉后，加入角蛋白14（keratin 14，K14）I抗4℃孵育過夜。添加熒光 II抗孵育 20 min，Hoechst（1∶1 000）染核 10 min。鏡下觀察，顯微鏡拍照。

3.5 EdU法檢測(cè)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖 角質(zhì)形成細(xì)胞以每孔1.6×104的密度接種于48孔板，培養(yǎng)3 d后，EdU標(biāo)記細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞固定以及Apollo染色。最后，Hoechst染核。鏡下觀察統(tǒng)計(jì)。胞核染為綠色熒光為EdU陽性細(xì)胞。鏡下每例隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，利用ImageJ軟件計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞的百分率。

3.6 CCK-8法檢測(cè)角質(zhì)形成細(xì)胞的活力 角質(zhì)形成細(xì)胞以每孔3.2×103的密度接種于96孔板。48 h換液。在不同時(shí)間段加入100 μL的含0.03 mmol/L Ca2+的培養(yǎng)基與CCK-8試劑10∶1的混合液，每次測(cè)量設(shè)置1個(gè)本底孔，孵育4 h。孵育前用DPBS洗2遍。孵育后用酶標(biāo)儀測(cè)量在450 nm的吸光度（A）值，測(cè)量值減去本底值為實(shí)際值。

3.7 TUNEL檢測(cè)角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡 角質(zhì)形成細(xì)胞以每孔1.6×104的密度接種于48孔板，細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，固定透膜，用Equihibration Buffer平衡25 min，TdT孵育緩沖液37℃孵育1 h。Hoechst染核。鏡下觀察統(tǒng)計(jì)。胞核顯示紅色熒光為TUNEL陽性細(xì)胞。鏡下每例隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，利用ImageJ軟件計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞的百分率。

3.8 結(jié)晶紫染色法檢測(cè)角質(zhì)形成細(xì)胞的集落形成率 將角質(zhì)形成細(xì)胞以每皿1.6×105的密度接種于3 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)3 d，應(yīng)用結(jié)晶紫染色方法，鏡下觀察細(xì)胞的集落形成情況并計(jì)數(shù)，僅計(jì)算集落的細(xì)胞數(shù)大于10的細(xì)胞團(tuán)。利用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)皿內(nèi)5個(gè)最大集落的面積并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用GraphPad Prism 7.0作圖，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較使用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 4種不同消化方式對(duì)成鼠背部皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞原代分離培養(yǎng)的影響

1.1 4種不同消化方式分離成年小鼠背部皮膚的消化時(shí)間對(duì)比 觀察分離成年小鼠真皮與表皮時(shí)表皮的狀態(tài)。用4種不同分離方式4℃分離表皮與真皮，可見中性蛋白酶消化14 h、胰蛋白酶消化16 h、中性蛋白酶與胰蛋白酶聯(lián)合消化20 h時(shí)，表皮與基底層的連接開始松散，部分表皮能從基底層分離。

在22～24 h時(shí)，采用4種不同的消化分離方法均可見表皮與基底層較為完整地分離。此時(shí)表皮較薄，呈半透明狀，能依靠水的張力平鋪在DPBS上，且有一定的韌性。

胰蛋白酶消化法消化超過24 h以及中性蛋白酶、聯(lián)合消化法消化超過30 h后，表皮能完整分離。但此時(shí)表皮無法平鋪于DPBS上，質(zhì)柔軟，并失去韌性，見表1。

表1 4種不同消化方式分離成年小鼠背部皮膚的消化時(shí)間對(duì)比Table 1 Comparison of digestive time for back skin isolated from adult mice by 4 different digestive methods

1.2 4種不同消化方式獲得成年小鼠背部表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的數(shù)量對(duì)比 利用4種不同分離方式分離2 cm×2 cm的皮膚組織，過濾獲得角質(zhì)形成細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，可以觀察到用中性蛋白酶與胰蛋白酶二步消化法所得到的細(xì)胞量最大，見圖1A。

1.3 4種不同消化方式獲得成年小鼠背部表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力的對(duì)比 CCK-8法檢測(cè)4種分離方法所獲得的原代角質(zhì)形成細(xì)胞的活力。原代種板24 h時(shí)，二步消化法獲得的細(xì)胞活力最高，聯(lián)合消化法最低。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，這一趨勢(shì)維持不變。在原代種板60 h時(shí)，二步法獲得的細(xì)胞活力仍然保持在最高，接下來是中性蛋白酶消化法與胰酶消化法，聯(lián)合消化法最低。由此可見二步法所得細(xì)胞的活力最強(qiáng)，聯(lián)合消化所得細(xì)胞的活力最弱，見圖2A。

EdU法驗(yàn)證細(xì)胞集落內(nèi)4種不同消化方式所得細(xì)胞的增殖能力。二步法與中性蛋白酶消化法所得細(xì)胞增殖效率最高，其次是胰蛋白酶消化法和聯(lián)合消化法。二步消化法與聯(lián)合消化法之間細(xì)胞增殖能力的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜0.05），見圖2B。

Figure 1.The changes of keratinocyte numbers obtained from adult mouse back skin by 4 different methods.A：the amount of cells obtained after centrifugation（scale bar=5 mm）；B：cell identification by immunofluorescence staining（scale bar=100 μm）.圖1 4種不同的消化方式影響成年小鼠背部皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的獲得數(shù)量

1.4 4種不同消化方式獲得成年小鼠背部表皮角質(zhì)形成細(xì)胞集落形成的對(duì)比 培養(yǎng)3 d后，統(tǒng)計(jì)4種不同分離方式所培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞所形成的集落數(shù)量以及大小。二步消化法以及胰酶消化法所形成的集落量最多，聯(lián)合消化法所獲得的集落量最低（P＜0.05）。然而，胰酶消化法所獲得的較大集落（直徑大于1 mm）量卻顯著減少，中性蛋白酶消化法所獲得的較大集落量僅次于二步消化法。聯(lián)合消化法所獲得的集落量與另外3種方法的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜0.05）。在統(tǒng)計(jì)集落面積時(shí)，我們得到了與上述一致的結(jié)果，二步法獲得的集落面積最大，聯(lián)合消化法所獲得的集落面積最?。≒＜0.05），見圖3。

2 不同培養(yǎng)條件對(duì)成鼠背部皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞原代分離培養(yǎng)的影響

2.1 不同種板條件對(duì)成鼠背部皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞原代分離培養(yǎng)的影響 為了探討不同種板條件對(duì)成鼠背部皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞原代分離培養(yǎng)的影響，本研究利用某種分離方法后，分離角質(zhì)形成細(xì)胞，分別采用普通平鋪種板和水滴狀種板2種形式進(jìn)行種板，其中，利用水滴狀種板方法種板并在0.5 h后補(bǔ)液，細(xì)胞貼壁36 h后結(jié)晶紫染色觀察，水滴狀種板細(xì)胞比傳統(tǒng)平鋪種板細(xì)胞貼壁更快，集落形成更多（P＜0.05），見圖4。

Figure 2.Four different methods affected the proliferation of keratinocytes from adult mouse back skin.A：the changes of the cell viability measurede by CCK-8 assay；B：the changes of cell proliferation detected by EdU assay.The scale bar=100 μm.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs Dispase II→Trypsin group.圖2 4種不同的消化方式影響成年小鼠背部皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力

2.2 乳鼠與成年小鼠最適宜種板密度的對(duì)比 乳鼠與成年小鼠以不同種板密度種板，乳鼠以3.2×104/cm2密度種板增殖效率較高。而以6.4×104/cm2密度種板時(shí)，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示此時(shí)的細(xì)胞活力低于以3.2×104/cm2密度種板的細(xì)胞活力。

而成年小鼠以1.6×104/cm2密度種板時(shí)細(xì)胞活力較高。以3.2×104/cm2密度種板時(shí)，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示此時(shí)的細(xì)胞活力低于以1.6×104/cm2密度種板的細(xì)胞活力。而以6.4×104/cm2密度種板時(shí)，細(xì)胞不貼壁，且細(xì)胞活力下降，見圖5。

3 乳鼠與成年小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞生物學(xué)功能的對(duì)比

3.1 乳鼠與成鼠角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)對(duì)比 在原代種板24 h后，可見乳鼠角質(zhì)形成細(xì)胞特征性鵝卵石樣細(xì)胞以及集落形成，且細(xì)胞集落融合度已較高，但有較多雜細(xì)胞，主要為黑素細(xì)胞，以及少量皮膚組織。隨著細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)增加，雜細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。在第3～4天時(shí)乳鼠角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞融合度即可達(dá)90%以上。培養(yǎng)初期凋亡細(xì)胞較少，細(xì)胞融合度較高時(shí)才開始有凋亡細(xì)胞脫落。

Figure 3.Four different methods affected the colony formation ability of the keratinocytes from adult mouse back skin.Statistical bar charts represent the number of colonies（n=5），the number of larger colonies（n=5），and the area of the colonies（n=15），respectively.Mean±SD.*P＜0.05 vs Dispase II group；△P＜0.05 vs Trypsin group；#P＜0.05 vs Dispase II+Trypsin group.圖3 4種不同分離方式影響成年小鼠背部皮膚原代角質(zhì)形成細(xì)胞的克隆集落形成

Figure 4.Two different plate patterns affected the colony formation ability of the keratinocytes from adult mouse back skin.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs normal group.圖4 2種不同種板方式影響成年小鼠背部皮膚原代角質(zhì)形成細(xì)胞的克隆集落形成

在原代種板24 h后，成年小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞中雜細(xì)胞較多，可見大量未貼壁，圓形較小的角質(zhì)形成細(xì)胞，但同時(shí)可見角質(zhì)形成細(xì)胞特征性鵝卵石樣集落。集落較少，且集落較小。培養(yǎng)初期便有相較于乳鼠明顯多的凋亡細(xì)胞。隨著原代培養(yǎng)時(shí)間延長，雜細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，集落數(shù)量逐漸增多，集落面積增大，同時(shí)集落之間開始互相融合。細(xì)胞融合度達(dá)60%時(shí)便有大量凋亡細(xì)胞脫落。在原代培養(yǎng)第7～10天時(shí)，集落融合度較高，鏡下幾乎無雜細(xì)胞，集落內(nèi)細(xì)胞連接緊密，可見部分分化的角質(zhì)形成細(xì)胞，鏡下呈扁平、橢圓狀，核較大，較未分化角質(zhì)形成細(xì)胞圓，面積較大，見圖6。

3.2 角質(zhì)形成細(xì)胞的鑒定 K14是基底層角質(zhì)形成細(xì)胞的陽性標(biāo)記物。鏡下可見培養(yǎng)細(xì)胞K14免疫熒光染色顯示為陽性，證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞為基底層角質(zhì)形成細(xì)胞，見圖1B。

3.3 乳鼠與成年小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力的對(duì)比 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在原代種板12 h內(nèi)，乳鼠與成鼠角質(zhì)形成細(xì)胞活力的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，而24 h后，乳鼠與成鼠原代角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞活力的差異逐漸增大，這一趨勢(shì)一直維持到原代種板60 h（P＜0.05），見圖7A。

EdU重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了在培養(yǎng)第4天時(shí)，乳鼠角質(zhì)形成細(xì)胞集落內(nèi)的EdU陽性細(xì)胞率大于成年小鼠（P＜0.05），見圖7B。

3.4 乳鼠與成年小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞集落形成效率的對(duì)比 培養(yǎng)3 d后，乳鼠角質(zhì)形成細(xì)胞已有大量集落形成，集落量、較大集落量、以及集落面積都大于成年小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞集落，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖8。

Figure 5.The cell viability of keratinocytes from neonatal mice and adult mice after planting with different densities.Statistical line charts represent the results of CCK-8 assay in different time periods.Mean±SD.n=5.圖5 乳鼠與成年小鼠的角質(zhì)形成細(xì)胞以不同密度進(jìn)行原代種板后活力的變化

3.5 乳鼠與成年小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞凋亡的對(duì)比 TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乳鼠與成年小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞集落內(nèi)凋亡細(xì)胞率，結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。暫未發(fā)現(xiàn)乳鼠與成年小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞在細(xì)胞凋亡方面存在差異（P＞0.05），見圖9。

討 論

1 消化條件對(duì)表皮-真皮分離和角質(zhì)形成細(xì)胞原代分離培養(yǎng)的影響

在本研究組培養(yǎng)成年小鼠背部皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞之前，目前尚未存在良好的成年小鼠背部皮膚真表皮分離方法。有研究嘗試?yán)檬中g(shù)刀對(duì)成年小鼠背部皮膚刮擦，從而分離表皮以進(jìn)行角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)［7］，但存在獲得的細(xì)胞量較少、無法獲得完整的基底層細(xì)胞、容易使細(xì)胞破裂失去貼壁與增殖能力，以及混入大量雜細(xì)胞等缺點(diǎn)。

我們通過不同消化方式（中性蛋白酶消化法、胰蛋白酶消化法、二步消化法、聯(lián)合消化法）以及時(shí)間的摸索，發(fā)現(xiàn)用4種不同的消化方法，4℃消化22 h左右能夠成功分離成年小鼠背部表皮與真皮，是最適宜的成年小鼠背部表皮與真皮的分離條件。同時(shí)，利用4種不同分離方式分離表皮與真皮后，通過分離表皮組織獲得角質(zhì)形成細(xì)胞，并對(duì)其功能狀態(tài)進(jìn)行對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)二步消化法獲得的細(xì)胞在增殖、集落形成等方面最優(yōu)，其次為中性蛋白酶消化法與胰蛋白酶消化法，最后是聯(lián)合消化法。

皮膚組織長期置于胰酶之中會(huì)降低基底層角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力，目前這一現(xiàn)象在大部分人源性角質(zhì)形成細(xì)胞的原代培養(yǎng)中也有發(fā)現(xiàn)［8］。中性蛋白酶通過消化分離基底層膠原，使表皮與真皮完整分離。同時(shí)短時(shí)間的胰酶消化有助于單個(gè)細(xì)胞的分離。因此，二步法能獲得較多且活性較好的細(xì)胞。

2 不同培養(yǎng)方式對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)的影響

水滴狀種板方法能讓細(xì)胞更快速沉降、貼壁，同時(shí)在一定程度上避免細(xì)胞的聚邊效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)均勻種板，使細(xì)胞集落均勻分布于培養(yǎng)皿內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，集落內(nèi)細(xì)胞逐漸增殖，集落面積逐漸增大、融合。

Figure 6.The morphological comparison of keratinocytes from neonatal mice and adult mice.The scale bar=100 μm.圖6 乳鼠與成年小鼠原代培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)對(duì)比

Figure 7.Comparison of proliferation of keratinocytes between neonatal mice and adult mice.A：the changes of cell viability measured by CCK-8 assay；B：the changes of cell proliferation detected by EdU assay.The scale bar=100 μm.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs P1 MICE group.圖7 乳鼠與成年小鼠原代角質(zhì)形成細(xì)胞增殖情況的對(duì)比

角質(zhì)形成細(xì)胞原代培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)還可能與Ca2+濃度、添加劑（如生長因子）、濕度、溫度、CO2濃度、生長基質(zhì)、維生素、營養(yǎng)物質(zhì)等有關(guān)。其中，Ca2+濃度是調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞狀態(tài)的主要影響因素之一［9］。Ca2+濃度過低，培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞無法有效貼壁、增殖。Ca2+濃度過高，角質(zhì)形成細(xì)胞迅速分化，失去原有增殖分裂能力［10］。在Ca2+濃度為0.03 mmol/L的無血清培養(yǎng)基中，角質(zhì)形成細(xì)胞能保持較高的增殖能力并表現(xiàn)出基底細(xì)胞的形態(tài)。而在Ca2+濃度高于0.1 mmol/L時(shí)，便會(huì)開啟細(xì)胞的終末分化模式［11］。因此，目前進(jìn)行正常角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基的Ca2+濃度通常維持在0.1 mmol/L以下［12］。在皮膚組織層面，表皮Ca2+濃度梯度、Ca2+通道能調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞的分化程度，改變皮膚表皮的pH值、屏障功能，并進(jìn)一步調(diào)控皮膚衰老［13-14］。

3 不同種板密度對(duì)乳鼠與成年小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞增殖差異的探討

人正常細(xì)胞，包括人角質(zhì)形成細(xì)胞在培養(yǎng)的過程中，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，細(xì)胞量增多，集落面積增大，集落融合，會(huì)觀察到接觸抑制的現(xiàn)象［15-16］。

Watt等［17］在人源性表皮基底層角質(zhì)形成細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，基底層角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞增殖、分化等功能與細(xì)胞形狀存在緊密的聯(lián)系。在細(xì)胞失去與周圍細(xì)胞或者基質(zhì)的連接時(shí)，細(xì)胞便會(huì)停止增殖，并開啟終末分化。除了癌細(xì)胞，在人類大部分正常細(xì)胞中，都存在著接觸抑制的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象有助于抑制腫瘤的形成，維持細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)態(tài)。角質(zhì)形成細(xì)胞之間通過鈣黏蛋白連接，鈣黏蛋白通過收縮在一定程度上調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖［18］。

我們發(fā)現(xiàn)不僅在細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞增殖能力隨著細(xì)胞密度增大逐漸減弱，而且在角質(zhì)形成細(xì)胞最初原代種板時(shí)，若種板密度過大都會(huì)直接導(dǎo)致細(xì)胞無法貼壁以及無法增殖。不僅無法形成鵝卵石狀集落，也無法形成單個(gè)橢圓形貼壁細(xì)胞。而細(xì)胞種板量較少時(shí)，單個(gè)細(xì)胞雖然能貼壁與增殖，但貼壁與增殖率較正常密度種板細(xì)胞顯著降低。因此，尋找一個(gè)適宜的中間種板密度范圍成為我們目前所關(guān)注的焦點(diǎn)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)乳鼠與成年小鼠的角質(zhì)形成細(xì)胞都存在高密度種板-增殖抑制（甚至不增殖）與低密度種板-增殖抑制的現(xiàn)象。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示乳鼠與成年小鼠對(duì)于種板密度的敏感性也存在著差異。乳鼠角質(zhì)形成細(xì)胞在種板密度為3.2×104/cm2到6.4×104/cm2時(shí)，細(xì)胞增殖抑制；而成年小鼠則在一個(gè)更低的種板密度時(shí)表現(xiàn)出增殖抑制現(xiàn)象。這可能是因?yàn)殡S著角質(zhì)形成細(xì)胞的衰老，胞膜表面鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)，鈣黏蛋白與肌動(dòng)蛋白穩(wěn)態(tài)失衡造成的。具體機(jī)制有待我們下一步的探討。

4 成年小鼠和乳鼠角質(zhì)形成細(xì)胞的對(duì)比

皮膚組織的衰老分為光老化與自然衰老。光老化過程中，真皮與表皮的厚度與結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，真皮的膠原組織、脂肪層與血管基質(zhì)結(jié)構(gòu)與數(shù)量改變［19］。角質(zhì)形成細(xì)胞在UVB的照射下變圓、皺縮、腫脹、細(xì)胞凋亡。并且這種變化與UVB的輻射劑量呈正相關(guān)［20］。而在個(gè)體自然衰老的過程中，表皮細(xì)胞連接減弱，基底層細(xì)胞增殖、分化減弱。而衰老的角質(zhì)形成細(xì)胞的貼壁能力、增殖能力與克隆團(tuán)形成效率都較年輕的角質(zhì)形成細(xì)胞明顯減弱。因此，在分離不同年齡小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞時(shí)，應(yīng)注意皮膚組織與細(xì)胞不同的處理方式。成年小鼠的皮膚較乳鼠厚，而表皮較乳鼠薄。若獲得細(xì)胞量較少，可在組織剪細(xì)后，振蕩組織懸液或適當(dāng)延長細(xì)胞懸液離心時(shí)間。注意在振蕩組織懸液時(shí)，不可一次振蕩過久或震蕩太過，否則細(xì)胞貼壁能力以及細(xì)胞活性下降，造成細(xì)胞無法貼壁或無法增殖。

基底層角質(zhì)形成細(xì)胞主要有平行增殖與向上分化兩種命運(yùn)。當(dāng)基底層細(xì)胞離開基底層時(shí)，它會(huì)停止增殖并開始向上分化為棘層、顆粒層、透明層以及角質(zhì)層［21］。

Figure 8.Comparison of colony formation efficiency between neonatal mouse keratinocytes and adult mouse keratinocytes.Statistical bar charts represent the number of colonies（n=5），the number of larger colonies（n=5），and the area of the colonies（n=15），respectively.Mean±SD.*P＜0.05 vs P1 MICE group.圖8 乳鼠與成年小鼠原代角質(zhì)形成細(xì)胞克隆集落形成對(duì)比

Figure 9.Comparison of apoptosis in the keratinocytes between neonatal mice and adult mice.Statistical bar charts represent the rates of TUNEL positive cells in a single colony.The scale bar=100 μm.Mean±SD.n=5.圖9 乳鼠與成年小鼠原代角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡情況對(duì)比

成年小鼠皮膚厚度遠(yuǎn)厚于乳鼠，主要因?yàn)槌赡晷∈笥休^厚的富含脂肪、毛細(xì)血管的皮下結(jié)締組織。然而，乳鼠的表皮較成年小鼠厚。出生1 d的乳鼠表皮層數(shù)已基本完整。在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，乳鼠與成年小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞在細(xì)胞黏附、集落形成、增殖等方面都存在顯著差異。在肉眼觀察時(shí)，成年小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞總體凋亡量較乳鼠角質(zhì)形成細(xì)胞多。但在進(jìn)行TUNEL實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行定量分析后，結(jié)果顯示成年小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞集落內(nèi)細(xì)胞凋亡率與乳鼠角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

目前，小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)還受到許多的局限，原代培養(yǎng)易受到黑色素細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等雜細(xì)胞的污染。同時(shí)，角質(zhì)形成細(xì)胞的生長受到表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、神經(jīng)生長因子和胰島素樣生長因子家族以及肝細(xì)胞生長因子的影響，此外粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和內(nèi)皮素-1通過轉(zhuǎn)化生長因子β、維生素D3和干擾素γ來抑制它們的生長。它們能夠調(diào)節(jié)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化，并且調(diào)節(jié)皮膚的炎癥與免疫反應(yīng)［22］。同時(shí)，目前角質(zhì)形成細(xì)胞傳代后增殖效率顯著下降，且傳代次數(shù)有限，都是相關(guān)領(lǐng)域所面對(duì)的重大難題。

為了增加角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖與貼壁效率，許多科研工作者們?cè)谠騻鞔N板前根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行鋪板。目前常用方式有3T3細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等作為滋養(yǎng)層，或利用膠原蛋白I、基質(zhì)膠、纖維連接蛋白、玻璃粘連蛋白等進(jìn)行預(yù)鋪板［23］。隨著基礎(chǔ)研究的不斷發(fā)展，小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞的原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)體系在不斷地完善。在未來，角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)體系的成熟不僅能夠給皮膚相關(guān)科研提供有力模型，也將給臨床治療帶來幫助，發(fā)揮重大作用。