姚元元

摘要：高效液相色譜（HPLC）法在樣本物質(zhì)含量的檢測中應(yīng)用廣泛，但是這一技術(shù)無法檢測對熒光和紫外沒有信號的物質(zhì)。衍生化將樣本中的待分析物轉(zhuǎn)化成合適的物質(zhì)形式以方便HPLC檢測，成為HPLC檢測的重要彌補手段。本文對當(dāng)前衍生化HPLC法測定藥物有效成分的應(yīng)用現(xiàn)狀作一綜述。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法;藥物;有效成分

藥物中的有效成分含量多少以及有效成分種類在評估藥物質(zhì)量與真?zhèn)沃蟹浅Ｖ匾?，鑒定、檢測藥物中的有效成分在藥品質(zhì)量控制中應(yīng)用廣泛。高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography， HPLC）法是藥品有效成分分離與分析的常用方法，但是儀器的熒光、紫外檢測器對藥物中的醇類、氨基酸類、羧酸類以及脂肪酸類有效成分檢測效果并不理想。衍生化技術(shù)將藥品中的成分衍生化為合適的成分來進行檢測，這使得HPLC的檢測范圍得到了擴大，也提高了檢測靈敏度。

1、衍生化HPLC

衍生化（derivatization）技術(shù)采用試劑將樣本中的待分析物轉(zhuǎn)化為更適合的物質(zhì)形式，從而為檢測提供方法。衍生化技術(shù)能夠消除基質(zhì)的干擾，增強離子化效率或者改變分析物的理化性質(zhì)，能夠提高物質(zhì)的分離程度，使得目標(biāo)選擇性與檢測儀器的靈敏度得到提高[1]。衍生化HPLC在生物、環(huán)境、食品以及醫(yī)藥等各個領(lǐng)域的痕量分析物檢測中均應(yīng)用廣泛。

從衍生有沒有與HPLC聯(lián)機的角度劃分，可以將化學(xué)衍生法分為離線與在線兩種;根據(jù)衍生化反應(yīng)的發(fā)生部位來劃分，可以將其劃分為柱前、柱中以及柱后衍生化法。在線柱中衍生化法在手性藥物分離對映體中應(yīng)用廣泛，其根據(jù)藥物與衍生化試劑對映體的反應(yīng)來形成非對映體的產(chǎn)物;衍生化法改變藥物成分的官能團，從而使其具有理想的熒光檢測信號與紫外檢測信號，提高檢測靈敏度與檢測范圍。上述兩種原理不同，因此文章中僅對當(dāng)前應(yīng)用廣泛的在線柱后衍生化法與柱前衍生化進行討論。

2、常用衍生化HPLC法的應(yīng)用現(xiàn)狀

2.1 柱前衍生化法

柱前衍生化反應(yīng)容易操作，可以采用手工離線的方法實現(xiàn)樣品的純化與反應(yīng)，對容積、混合試劑的要求不高，對試劑用量、反應(yīng)條件以及反應(yīng)時間等都要求不高。該方法能提高檢測的靈敏度，還有助于提高色譜分辨率與分離方法的選擇性。

對氨基酸類藥物進行測定時，2，4-二硝基氟苯是最常用的試劑。醇類是表面活性劑的關(guān)鍵原料之一，特別是脂肪醇乙氧基化合物在化妝品行業(yè)與藥物中都應(yīng)用廣泛，其對環(huán)境具有一定污染性。對醇類化合物的測定方法進行優(yōu)化，其應(yīng)用價值較高。陳哲等[2]建立柱前衍生反相HPLC對琺菲亞中的14種氨基酸進行同時測定，衍生化試劑為異硫氰酸苯酯，建立了14種氨基酸同時測定的方法。李滋等[3]采用苯甲醛作為衍生化試劑，對異煙肼注射液中游離脛的含量進行檢測，發(fā)現(xiàn)游離脛檢出限為0.5g/ml，為異煙肼注射液質(zhì)控提供了檢測方法。

2.2 柱后衍生化法

這一反應(yīng)在檢測器與色譜柱之間的反應(yīng)器完成，其屬于在線衍生化方法。就反應(yīng)器方面，由不銹鋼、聚四氟乙烯、玻璃等制成的管狀反應(yīng)器是最為簡單的反應(yīng)器，可以應(yīng)用于滯留時間不超過30s的快速反應(yīng)。例如將鄰苯二甲醛（OPA）作為柱后衍生試劑，與氨基酸發(fā)生反應(yīng)，能夠盡可能避免柱前手動衍生物可能存在的不穩(wěn)定因素，該方法的靈敏度與分辨率均較高。柱床反應(yīng)器適用于1-5min滯留時間的中等速度的反應(yīng)，其在反應(yīng)器內(nèi)填充固定化酶制成穩(wěn)定的柱床，通入底物溶液，流動相經(jīng)過玻珠時與玻珠上的衍生化反應(yīng)物發(fā)生反應(yīng)，根據(jù)一定流速來收集轉(zhuǎn)化液。載流式反應(yīng)器適用于滯留時間在5min以上的反應(yīng)，其盤管細長，出于減少峰擴張的目的，試劑與洗脫液混合的過程中要將空氣不斷打入，或者打入不溶于流動相的容積，從而促使溶液在分割的情況下流動，這一方法可維持峰擴張不超過10%。除此之外，光化學(xué)檢測反應(yīng)器適用于一些僅需光照即可完成結(jié)構(gòu)變化的反應(yīng)物。

就柱后衍生化的試劑選擇方面，OPA是氨基酸、胺的柱后衍生化試劑，其與氨基酸發(fā)生反應(yīng)，生成熒光衍生物，其具有快速、靈敏的特點，檢測效果良好，是柱后衍生化的常用試劑。張楊慧等[4]應(yīng)用OPA進行柱后衍生化，建立了硫酸卡那霉素注射液及滴眼液含量的檢測方法，發(fā)現(xiàn)卡那霉素在0.0973-583.8g/ml濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好（r=0.9999）。蘇小潔[5]采用濃度0.05%的碘溶液作為衍生試劑，采用免疫親和柱凈化-柱后衍生高效液相色譜熒光法檢測山楂黃曲霉素B1、B2、G1、G2含量，發(fā)現(xiàn)其最低檢出限分別為0.6pg、0.1pg、0.7pg、0.2pg。

3、結(jié)論

衍生法HPLC以柱前衍生化法與柱后衍生化法比較常用。前者優(yōu)點眾多，但是部分衍生化后的部分化合物反應(yīng)產(chǎn)物種類較多，這使得樣品組分有時候會出現(xiàn)多個色譜峰而使得色譜圖變得非常復(fù)雜，因此柱前衍生化法的應(yīng)用有一定限制。柱后衍生化法在經(jīng)過色譜柱分離后、進入檢測器前進行，因此這一方法可以連續(xù)、自動地進行，具有容易操作的優(yōu)勢。由于該方法在分離后完成衍生化，這使得色譜分離能將樣品自身的性質(zhì)反應(yīng)出來。柱后衍生化法也存在一定限制，例如要求衍生化反應(yīng)具有良好重現(xiàn)性，要求控制反應(yīng)時間，還要求過量衍生試劑與反應(yīng)后生成的副產(chǎn)物不能對檢測造成影響，受到這些限制，柱后衍生化法的應(yīng)用還并不廣泛。但是總的來說，衍生化法HPLC的發(fā)展前景廣闊。

參考文獻

[1]何繼杰，張曉鳳，錢莉莉，等.痕量氨基酸分析方法研究進展[J].分析科學(xué)學(xué)報，2019，35（04）：507-513.

[2]陳哲，路娟，彭紀(jì)銘，等.柱前衍生RP-HPLC法同時測定琺菲亞中14種水解氨基酸[J].藥學(xué)實踐雜志，2017，35（02）：130-133.

[3]李滋，于潤芳，侯寧，等.柱前衍生化HPLC法測定異煙肼注射液中游離肼的含量[J].藥物分析雜志，2017，37（02）：316-319.

[4]張楊慧，蔣孟虹，秦峰，等.柱后衍生化-HPLC法測定硫酸卡那霉素注射液及滴眼液的含量[J].中國抗生素雜志，2019，44（01）：88-93.

[5]蘇小潔，潘顯茂.用免疫親和柱凈化-柱后衍生高效液相色譜熒光法檢測山楂干中多種黃曲霉毒素含量的效果觀察[J].當(dāng)代醫(yī)藥論叢，2018，16（16）：189-190.