宋緒佳，張時君，呂文鑫，黃 林，張 言，吳明貴#，謝少偉#

1.廣西壯族自治區(qū)柳州市工人醫(yī)院，廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院泌尿外科，柳州545005；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，上海200127

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)較常見的惡性腫瘤[1-2]，內(nèi)分泌治療后大部分會轉(zhuǎn)變?yōu)槿莸挚剐郧傲邢侔╟astration-resistant prostate cancer，CRPC），其預(yù)后較差。多西他賽（docetaxel，DTX）是CRPC一線化學(xué)治療（化療）藥物，然而隨著治療的進行，大部分患者對其產(chǎn)生抗性[3-4]。因此，如何解決CRPC對DTX的耐藥問題引起了廣泛關(guān)注[5-6]。快速發(fā)展的納米技術(shù)為我們提供了一個很好的藥物遞送手段[7-8]，解決了一些疏水藥物難溶解、多種藥物具有不同藥代動力學(xué)行為的問題。并且由于納米載體本身的特性，一些新興治療手段也應(yīng)運而生，如光動力治療、光熱治療及基因治療等[9-13]。光熱治療利用光敏劑的高效光熱轉(zhuǎn)換效率，實現(xiàn)局部、非入侵式、選擇性殺死被光吸收劑納米顆粒結(jié)合并暴露在近紅外光下的靶細胞，并在多種腫瘤模型中表現(xiàn)出了巨大的治療潛力[14-15]。當(dāng)藥物負載到作為光敏劑的納米載體后，還可實現(xiàn)靶向給藥、精準(zhǔn)釋放的目的，從而降低化療藥物在非靶點的系統(tǒng)毒性。然而納米材料由于其粒徑較大（數(shù)十納米至數(shù)微米），當(dāng)其通過靜脈給藥后，大多數(shù)納米載體可被內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)（reticular endothelial system，RES）識別，從而降低了納米材料的靶向效率。而聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修飾后的納米材料一定程度上可以避免被RES所捕獲，而增加其血液循環(huán)時間，進而通過實體瘤組織中血管的高通透性和滯留效應(yīng)（enhanced permeability and retention effect，EPR）增加了藥物納米載體的靶向效率。近幾年，大量臨床前研究[16-17]表明，納米載體本身帶來的光熱治療方式往往與常規(guī)化療起到協(xié)同抑瘤的作用，而使得腫瘤耐藥性得到改善，很大程度上改善患者的預(yù)后及治療效果。因此，以納米載體為基礎(chǔ)，探討光熱治療與化療協(xié)同的抑瘤機制，增敏化療效果，在臨床上具有重要的意義。本研究以被截短的單壁碳納米管（shorten singlewalled carbon nanotubes，s-SWCNTs）為載體，并將DTX負載到其表面后，探討化療和光熱對CRPC細胞系C4-2的協(xié)同殺傷作用及體內(nèi)抑瘤效果。

1 材料與方法

1.1 細胞與動物

C4-2細胞由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院干細胞中心提供。Balb/c裸鼠購于上海斯萊克動物實驗中心（Slac Laboratory，中國），生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2017-0005，在（20±2） ℃、（60±10） %相對濕度、12 h光照/黑暗循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)條件下進行飼養(yǎng)。所有動物實驗均按照實驗動物管理條例規(guī)定進行，并經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物保護與護理委員會批準(zhǔn)，動物使用許可證號為SYXK（滬）2016-0009。

1.2 材料與試劑

單壁碳納米管（single-walled carbon nanotubes，SWCNTs）純度＞95%，購于中國科學(xué)院成都有機所有限公司；PEG購于Polyvivo公司（美國）；DTX純度＞99%，購于USP公司（美國）；體外培養(yǎng)所需的胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、PRMI-1640培養(yǎng)基及青鏈霉素混合液購于Gibco公司（美國）；CCK-8試劑盒購于日本同仁公司；透析袋，截留相對分子質(zhì)量為3 500，購于上海國藥集團；實驗中所涉及的化學(xué)試劑，如乙醇、濃H2SO4、濃HCl等均為分析純，購于上海國藥集團。

1.3 主要儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），倒置熒光顯微鏡（日本Leica公司），紫外分光光度儀Lambda 950（美國PerkinElmer公司），冷凍離心機（美國Thermo公司），酶標(biāo)儀SpectraMax M5（中國美谷分子儀器有限公司），紅外熱像儀（美國菲力爾公司），高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），傅里葉變換紅外光譜（瑞士梅特勒-托利多公司），Zeta電位儀（英國馬爾文公司），自動電導(dǎo)滴定儀（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.4 DTX@s-SWCNTs/PEG的制備與表征

1.5 DTX@s-SWCNTs/PEG的體外釋藥行為

上述制備的DTX@s-SWCNTs/PEG（1 mg SWCNTs，1.23 mg DTX）重新溶解在pH值為6.5的0.5 mL磷酸緩沖溶液（PBS）中（含10%吐溫），轉(zhuǎn)移至透析袋后（截留相對分子質(zhì)量3 500），并將其放入20 mL相同pH值的PBS中，以37 ℃、300 r/min的條件孵育48 h。在預(yù)定的時間點，收集200 μL溶液，并使用高效液相色譜法測定釋放到樣品中的DTX含量。為測定藥物累積釋放曲線，在每個采樣點都用相同體積新鮮PBS（200 μL）替換樣品。所有實驗點采取3次平行試驗進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析。

1.6 DTX@s-SWCNTs/PEG的體外光熱行為

將制備的DTX@s-SWCNTs/PEG配制為一系列濃度的水溶液（0～100 μg/mL），在1 W/cm2功率密度的808 nm激光照射下，通過紅外熱像儀來檢測溶液溫度的變化。為監(jiān)測納米系統(tǒng)的光熱穩(wěn)定性，將30 μg/mL的DTX@s-SWCNTs/PEG溶液置于功率密度為2 W/cm2的激光下輻射3 min后，關(guān)閉激光，室溫恢復(fù)5 min，循環(huán)3次以觀察溶液溫度變化趨勢，并繪制出溫度-時間函數(shù)關(guān)系曲線。

1.7 DTX@s-SWCNTs/PEG的體外毒性研究

將C4-2細胞培養(yǎng)于96孔板中，每孔細胞為2×103個，培養(yǎng)24 h后，進行如下操作：①為了檢測納米系統(tǒng)的生物安全性，將含不同濃度的s-SWCNTs/PEG的完全培養(yǎng)液（0～100 μg/mL）加入到培養(yǎng)的細胞中，再孵育24 h后，用PBS清洗3次，再加入含CCK-8檢測液的新鮮培養(yǎng)液后在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～3 h，隨后用酶標(biāo)儀檢測細胞的吸光度值，與未添加材料細胞的吸光度值進行比較，來確定細胞的活性。②為了檢測光熱特性對細胞的潛在毒性，經(jīng)過上述相同的操作后，用1 W/cm2功率密度的激光每孔照射5 min，更換新鮮培養(yǎng)基，再孵育24 h后進行CCK-8檢測，來確定細胞的活力。③為了評估化療藥物DTX及DTX協(xié)同光熱對C4-2的毒性，將負載DTX的DTX@s-SWCNTs/PEG以上述相同的濃度及培養(yǎng)條件進行實驗，不經(jīng)過光照和經(jīng)過光照處理（1 W/cm2每孔照射5 min），再孵育24 h后，進行細胞活性評價。繪制細胞活性與材料濃度相關(guān)曲線。

1.8 DTX@s-SWCNTs/PEG的體內(nèi)抑瘤效果評估

2 結(jié)果

2.1 DTX@s-SWCNTs/PEG的表征

原始SWCNTs表面電位呈電中性，而經(jīng)過混酸60℃處理6 h后，電位急劇下降到（-31.3±0.9） mV（圖1A），通過自動滴定儀測試結(jié)果得到每克SWCNTs所含-COOH的量為0.412 mol（圖1B）。傅里葉變換紅外光譜（fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）譜圖中，約1 800 cm-1處 的C=O伸縮振動峰表明-COOH成功引入（圖1C）。而此時SWCNTs的長度由原來的5～30 μm截短為1～3 μm（s-SWCNTs）。為進一步改善s-SWCNTs在體內(nèi)的生物相容性，氨基封端的PEG（相對分子質(zhì)量30 000）通過酰胺鍵與s-SWCNTs表面引入的-COOH進行反應(yīng)，而使得PEG成功地負載到s-SWCNTs的表面（s-SWCNTs/PEG），此時，Zeta電位上升至（-17.3±0.8） mV（圖1A）。最后通過納米沉淀法使DTX的芳香結(jié)構(gòu)與s-SWCNTs的疏水表面形成π-π堆積而將化療藥物DTX負載到s-SWCNTs上[18]。通過紫外-可見光吸收光譜可見，s-SWCNTs在約250 nm處形成新峰，表明DTX被成功地負載（圖1D）。最終DTX@s-SWCNTs/PEG表面電位為（-10.3±1.5） mV，且在水溶液及生理環(huán)境中表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性。

圖1 DTX@s-SWCNTs/PEG的制備及表征Fig 1 Preparation and characterization of DTX@s-SWCNTs/PEG

2.2 DTX@s-SWCNTs/PEG的體外載藥與釋藥行為

體外載藥實驗結(jié)果表明，隨著DTX的喂料比增加，DTX在s-SWCNTs上的負載量也逐漸增加（圖2A）。最終，每毫克s-SWCNTs可負載1.35 mg DTX?？紤]到藥物大量負載會增高納米系統(tǒng)的電位，而使得在生理環(huán)境中變得不穩(wěn)定，因此，本實驗采用1 mg SWCNTs負載1.23 mg DTX的納米系統(tǒng)為最終研究對象。通過高效液相色譜檢測DTX@s-SWCNTs/PEG在pH 6.5的PBS中的釋藥行為來模擬納米系統(tǒng)在腫瘤酸性條件下的藥物釋放行為（圖2B）。實驗結(jié)果表明，納米系統(tǒng)在12 h內(nèi)快速釋放，并且在24 h內(nèi)藥物釋放可高達（56.4±3.2） %，這種酸性釋藥行為也有利于DTX@s-SWCNTs/PEG在體內(nèi)對腫瘤的抑制。

圖2 DTX@s-SWCNTs/PEG的體外載藥（A）與釋藥（B）Fig 2 Drug loading (A) and release (B) profiles of DTX form DTX@s-SWCNTs/PEG

2.3 DTX@s-SWCNTs/PEG的體外光熱性能評估

由于SWCNTs在近紅外Ⅰ區(qū)域表現(xiàn)出強的吸收（圖1D），而賦予材料強的光熱性能，從而可使材料作為理想的光熱治療劑。因此，我們在體外首先評價了s-SWCNTs/PEG納米系統(tǒng)在808 nm激光輻射下的熱性能。當(dāng)激光以2 W/cm2的功率密度輻射30 μg/mL的納米系統(tǒng)時，紅外熱像儀表明s-SWCNTs/PEG水溶液被快速地加熱（圖3A）。僅輻射3 min就可使體系最高溫升至（52.6±0.8） ℃；輻射10 min后，體系溫度高達（60.7±1.6） ℃。進一步探討體系溫度與輻射時間關(guān)系的實驗表明，在1 W/cm2的激光功率密度下，隨著納米載體系統(tǒng)濃度的增加（10～100 μg/mL），其溫度也逐漸升高（圖3B）。最后，材料的光熱穩(wěn)定性能結(jié)果表明，高濃度的納米載體（30 μg/mL）在高光照功率密度（2 W/cm2）循環(huán)照射下，材料熱性能并未發(fā)生變化。每次光照循環(huán)下，材料都能達到最大的溫度，且關(guān)閉激光后，系統(tǒng)也能在一定時間內(nèi)恢復(fù)至室溫（圖3C）。

圖3 DTX@s-SWCNTs/PEG體外光熱性能表征Fig 3 Photothermal performance of DTX@s-SWCNTs/PEG in vitro

2.4 DTX@s-SWCNTs/PEG的體外細胞毒性評價

CCK-8實驗結(jié)果表明，光熱、化療對C4-2細胞表現(xiàn)出協(xié)同殺傷作用（圖4）。而不同濃度的材料與C4-2共培養(yǎng)24 h的結(jié)果表明，材料沒有表現(xiàn)出明顯的細胞毒性（圖4A）[19]。受到激光輻射后（1 W/cm2，5 min），材料展現(xiàn)出明顯的細胞毒性，且隨著濃度進一步增加，細胞活性逐漸降低?；熕幬锒拘员O(jiān)測實驗表明，負載到s-SWCNTs的DTX的毒性高于游離的DTX藥物（圖4B），進一步進行光照處理，其細胞活性進一步下降。即使在較低的材料濃度下（5 μg/mL），聯(lián)合治療也表現(xiàn)出較高的細胞毒性，此時細胞存活率只有（43.2±5.7） %。這些實驗結(jié)果表明負載DTX的s-SWCNTs納米系統(tǒng)表現(xiàn)出協(xié)同的化療-光熱殺傷作用，可進一步用于負瘤小鼠的光熱-化療協(xié)同治療。

圖4 DTX@s-SWCNTs/PEG對C4-2細胞的協(xié)同化療-光熱體外毒性表征Fig 4 Synergetic chemo-photothermal combination therapy with DTX@s-SWCNTs/PEG in C4-2 cells

2.5 DTX@s-SWCNTs/PEG的體內(nèi)協(xié)同抑瘤作用

評估材料體外協(xié)同抑制C4-2細胞的生長后，進一步評估了其體內(nèi)協(xié)同抗瘤效果。s-SWCNTs/PEG納米復(fù)合物靜脈注射荷瘤小鼠24 h后，進行光照處理。紅外熱像儀數(shù)據(jù)表明，當(dāng)小鼠腫瘤暴露于2 W/cm2的光照功率密度下，腫瘤部位溫度迅速上升，僅照射5 min，腫瘤溫度高達65.7 ℃（圖5A）。為避免對正常組織造成損傷，實驗中選擇適度的光照功率密度（1 W/cm2）對腫瘤部位光照5 min，作為腫瘤的最佳光照條件。此時，腫瘤溫度保持在約50 ℃。多種處理方式治療后，對小鼠腫瘤體積監(jiān)測表明（圖5B），化療對腫瘤有輕微的抑制作用，光照組雖然能較快地消融原發(fā)瘤，但在治療2周后腫瘤復(fù)發(fā)；而聯(lián)合組對腫瘤的抑制效果最明顯，且在3周的實驗觀察期沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)。小鼠的體質(zhì)量實驗監(jiān)測結(jié)果表明，s-SWCNTs/PEG和DTX@s-SWCNTs/PEG納米系統(tǒng)在體內(nèi)并沒有表現(xiàn)出明顯的毒性（圖5C）。綜合上述結(jié)果表明，負載DTX的s-SWCNTs納米系統(tǒng)在體內(nèi)表現(xiàn)出協(xié)同的抑制前列腺癌的作用，可避免單一治療的不足及化療藥物產(chǎn)生的抗藥性。

圖5 體內(nèi)化療-光照協(xié)同抑瘤作用評價Fig 5 Synergetic therapeutic effect of chemo-photothermal therapy

3 討論

CRPC在臨床上往往以化療藥物（如DTX）為主，而單一化療往往效果不理想，且長時間、大劑量用藥后，腫瘤表現(xiàn)出抗性。而光熱治療可選擇性地對腫瘤進行殺傷，大量臨床前實驗結(jié)果[14-18,20]表明，熱處理可在一定程度上增敏化療效果，所以將光熱和化療藥物聯(lián)合，在臨床上具有巨大潛力。由于SWCNTs自身獨特的性能，可以將2種治療方式有機地結(jié)合起來。一方面，SWCNTs的高比表面積及疏水表面使其在載藥方面表現(xiàn)出優(yōu)異的特性[20-22]；另一方面，自身高效的光熱轉(zhuǎn)換效率也使其成為理想的光熱治療劑[17,23-24]。因此本研究以SWCNTs為藥物載體，在體內(nèi)、外評價了光熱-化療協(xié)同抑制CRPC的潛力。

原始SWCNTs的長度限制了其在生物體內(nèi)的應(yīng)用，經(jīng)過截短后，其尺寸有利于體內(nèi)通過EPR效應(yīng)在腫瘤內(nèi)部富集。PEG修飾可避免其被RES吞噬，而增加其血液循環(huán)時間[25-26]。酸響應(yīng)釋放藥物的行為，一定程度上降低化療藥物對正常器官的毒性；與游離DTX相比，這種靶向遞送、精準(zhǔn)釋放使得DTX@s-SWCNTs/PEG納米系統(tǒng)表現(xiàn)出體內(nèi)應(yīng)用優(yōu)勢。對C4-2荷瘤小鼠治療結(jié)果同樣表明了光熱-化療協(xié)同作用的優(yōu)勢，DTX@s-SWCNTs/PEG納米系統(tǒng)不僅能快速地消融腫瘤，還避免了腫瘤的復(fù)發(fā)。并且這種基于s-SWCNTs的化療-熱療聯(lián)合模式治療，在本研究中的劑量下（靜脈注射10 mg/kg），表現(xiàn)出高的生物相容性。

總之，由于SWCNTs獨特的物理結(jié)構(gòu)及高效的光熱轉(zhuǎn)化性能，不僅使其可作為理想的藥物載體，還可作為強有力的光熱治療劑。當(dāng)DTX以1.23:1（質(zhì)量比）的比例負載到PEG修飾的s-SWCNTs后，納米系統(tǒng)同時擁有化療及光熱治療特性。體外釋藥行為表明，DTX可在酸性環(huán)境中快速地從納米載體上釋放出來，這有利于腫瘤酸性環(huán)境中的釋藥行為。納米系統(tǒng)在體外對C4-2細胞表現(xiàn)出化療-光熱協(xié)同的殺傷作用，并且在體內(nèi)成功消融C4-2移植瘤模型小鼠的腫瘤，避免單一療法帶來的不足，且成功阻止了腫瘤的復(fù)發(fā)。綜上，本實驗結(jié)果表明，基于SWCNTs的化療-光熱協(xié)同治療系統(tǒng)具有抑制前列腺癌的巨大潛力，可顯著增敏化療藥物療效，為前列腺癌的治療提供了新方向。