上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海市婦科腫瘤重點實驗室，上海 200127

在婦科惡性腫瘤中，卵巢癌的惡性程度及死亡率均位列第一[1]。由于卵巢癌起病隱匿且缺乏早期檢測方法，超過70%的患者在初診時即已發(fā)生癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。盡管晚期卵巢癌患者可從腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)及紫杉醇聯(lián)合鉑類一線化學(xué)治療（化療）中獲益，但75%以上的晚期患者仍會復(fù)發(fā)并最終導(dǎo)致死亡[2]。已有研究[3]證實卵巢癌的微環(huán)境免疫特征與患者預(yù)后密切相關(guān)，即與無腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（尤其是CD3+T細(xì)胞）的卵巢癌患者相比，存在有該細(xì)胞的卵巢癌患者的5年生存率提高了8倍（4.5%vs38%）。

在腫瘤微環(huán)境中，免疫細(xì)胞的遷移及激活與趨化因子家族密切相關(guān)。其中，趨化因子CXCL9（C-X-C motif chemokine ligand 9）及相關(guān)趨化因子受體CXCR3（C-X-C motif chemokine receptor 3）發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[4-6]。CXCL9是一種響應(yīng)干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）誘導(dǎo)且參與免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞生長、遷移及激活的趨化因子。當(dāng)CXCL9與表達(dá)于單核細(xì)胞、激活T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK cell，簡稱NK細(xì)胞）、樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）表面的CXCR3相結(jié)合，可介導(dǎo)淋巴細(xì)胞浸潤至病灶部位以發(fā)揮免疫細(xì)胞抗腫瘤功能。在穩(wěn)態(tài)中，CXCL9于單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中低水平表達(dá)，但在IFN-γ和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等細(xì)胞因子刺激下其表達(dá)將顯著上調(diào)[4,7-8]。Gorbachev等[9]對小鼠體內(nèi)的研究發(fā)現(xiàn)，與表達(dá)CXCL9的腫瘤細(xì)胞相比，存在CXCL9表達(dá)缺陷的腫瘤細(xì)胞具有更強的成瘤性，繼而推測CXCL9表達(dá)缺失是腫瘤細(xì)胞逃避抗腫瘤免疫反應(yīng)的一種機制。研究者對腫瘤微環(huán)境進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CXCL9表達(dá)受IFN-γ誘導(dǎo)上調(diào)，并能夠與T、B和NK細(xì)胞表達(dá)的CXCR3結(jié)合以募集淋巴細(xì)胞至腫瘤微環(huán)境[5-6]。同時有較多實驗[10-12]表明，CXCL9表達(dá)不足會大大削弱免疫細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

基于此，本研究以癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中卵巢癌組織測序數(shù)據(jù)集進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探究CXCL9mRNA表達(dá)對總體生存期的影響，并通過基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）挖掘CXCL9mRNA在卵巢癌中的生物學(xué)功能，分析CXCL9mRNA表達(dá)與細(xì)胞分化抗原8A（cluster of differentiation 8A，CD8A）及免疫檢查點的mRNA表達(dá)的相關(guān)性，以期為免疫檢查點阻斷治療卵巢癌的生物標(biāo)志物研究提供可能性依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

UCSC（https://xenabrowser.net/datapages/）是一個被公認(rèn)的能夠?qū)CGA數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化清洗與處理的網(wǎng)站。本研究從該網(wǎng)站下載獲得由AffyU133A基因芯片測量得到的TCGA漿液性卵巢癌數(shù)據(jù)集。同時，本研究使用的另一部分?jǐn)?shù)據(jù)來源于R包curatedOvarianData[13]，共包含來自23項研究中的2 970個患者的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)及生存數(shù)據(jù)，其中有16組研究的樣本表達(dá)譜和患者生存數(shù)據(jù)可用于計算中位生存期，具體數(shù)據(jù)集包括E.MTAB.386、GSE13876、GSE14764、GSE17260、GSE18520、GSE19829、GGSE26193、GSE26712、GSE30161、GSE32062、GSE49997、GSE51088、GSE9891、PMID17290060c、TCGARNAseqV2、TCGA。

1.2 CXCL9 mRNA表達(dá)及其與總體生存期的相關(guān)性分析

采用Log-rank檢驗法對來自GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）網(wǎng) 站[14]的TCGA漿液性卵巢癌組織與癌旁組織中CXCL9mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行分析。根據(jù)CXCL9的每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的轉(zhuǎn)錄本（transcripts per kilobase of exon model per million mapped reads，TPM）中位數(shù)，將424個漿液性卵巢癌組織分為CXCL9低表達(dá)組（212例）與CXCL9高表達(dá)組（212例）。采用Kaplan-Meier法分析2組組織中CXCL9mRNA表達(dá)對卵巢癌患者總體生存期的影響。同時，本研究使用由R包curatedOvarianData[13]內(nèi)含的卵巢癌樣本數(shù)據(jù)及其相應(yīng)臨床數(shù)據(jù)繪制森林圖，探究大樣本基數(shù)下CXCL9mRNA對卵巢癌患者總體生存期的影響。

1.3 GSEA

于GSEA門戶網(wǎng)站（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）下載GSEA軟件[15]。GSEA是一種計算方法，用來確定一組先驗基因在2種生物狀態(tài)之間是否表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)上的顯著一致性差異。GSEA軟件包含分子簽名（Molecular Signatures Database，MSigDB）數(shù)據(jù)庫，研究人員可以從該數(shù)據(jù)庫中選擇感興趣的功能基因集進(jìn)行分析。本研究選用GSEA軟件內(nèi)附帶的MSigDB數(shù)據(jù)庫中的c2.cp.kegg.v.7.0功能基因集，將TCGA漿液性卵巢癌數(shù)據(jù)集全基因表達(dá)譜作為輸入文件，計算c2.cp.kegg.v.7.0功能基因集中各生物學(xué)通路在CXCL9高表達(dá)組與CXCL9低表達(dá)組中的差異，最終得出基因集在2組中的富集評分。

1.4 CXCL9 mRNA表達(dá)與CD8A及免疫檢查點mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析

使用在線分析網(wǎng)站GEPIA的correlation功能，計算CD8A、程序性死亡受體-1（programmed death-1，PD-1）、程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T-lymphocyteassociated protein 4，CTLA4）的mRNA表達(dá)與CXCL9mRNA表達(dá)之間的關(guān)系。將log2（CXCL9TPM）作為X軸，依次將log2轉(zhuǎn)換后的CD8A、PD-1、CTLA4及PD-L1的TPM值作為Y軸，使用Pearson相關(guān)分析研究其表達(dá)間的相關(guān)性，并采用t檢驗判定該相關(guān)性是否具有顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)后相關(guān)預(yù)測因子分析

本研究針對GEPIA網(wǎng)站提供的TCGA漿液性卵巢癌組織和癌旁組織的CXCL9mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果（圖1A）顯示CXCL9mRNA在卵巢癌組織中的表達(dá)水平較高（P＜0.05），繼而提示CXCL9表達(dá)具有腫瘤組織特異性。隨后，使用Kaplan-Meier法評估CXCL9高表達(dá)組與CXCL9低表達(dá)組的生存曲線，結(jié)果（圖1B）顯示在TCGA漿液性卵巢癌數(shù)據(jù)中，CXCL9是漿液性卵巢癌預(yù)后良好的預(yù)測因子（Log-rankP=0.010）。

圖1 CXCL9 mRNA在TCGA漿液性卵巢癌組織中的表達(dá)情況及總體生存期分析Fig 1 Analysis of CXCL9 mRNA expression and overall survival in TCGA serous ovarian cancer tissues

由于TCGA數(shù)據(jù)庫中的卵巢癌樣本均為漿液性卵巢癌，為擴大卵巢癌的組織學(xué)類型，本研究使用R包curatedOvarianData中的16組研究的樣本表達(dá)譜及患者生存數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析，即將趨化因子CXCL9表達(dá)作為整體生存的單變量預(yù)測因子并繪制森林圖；其中，風(fēng)險比（hazard ratio，HR）＞1表示CXCL9mRNA表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)，HR＜1則表示與預(yù)后良好相關(guān)。結(jié)果（圖2）顯示僅有GSE19829、GSE14764、GSE26193數(shù)據(jù)集的HR＞1，提示CXCL9mRNA表達(dá)或與卵巢癌預(yù)后不良相關(guān)。

圖2 卵巢癌數(shù)據(jù)集中CXCL9 mRNA表達(dá)與總體生存期的森林圖Fig 2 Forest plot of the expression of CXCL9 mRNA in ovarian cancer datasets

2.2 CXCL9 mRNA表達(dá)在TCGA漿液性卵巢癌組織中的生物學(xué)功能分析

本研究使用TCGA 漿液性卵巢癌數(shù)據(jù)集，根據(jù) GSEA中的c2.cp.kegg.v.7.0 功能基因集對CXCL9高表達(dá)組與CXCL9低表達(dá)組的組織進(jìn)行富集分析，結(jié)果（圖3）顯示與免疫細(xì)胞遷移、激活有關(guān)的功能通路在CXCL9高表達(dá)組中的表達(dá)均較高，而在CXCL9低表達(dá)組中則較低；繼而提示，CXCL9mRNA表達(dá)主要與細(xì)胞因子及其受體相互作用通路、NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性通路、Janus激酶（Janus kinase，JAK）-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄活化子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號通路、白細(xì)胞跨膜通路、T細(xì)胞受體信號通路以及抗原加工與提呈通路顯著相關(guān)；從而推斷，在卵巢癌微環(huán)境中，CXCL9mRNA高表達(dá)或?qū)γ庖呒?xì)胞遷移、激活等功能發(fā)揮重要作用。

圖3 GSEA研究CXCL9 mRNA表達(dá)在TCGA漿液性卵巢癌組織中的生物學(xué)功能Fig 3 Analyze the biological function of the expression of CXCL9 mRNA in TCGA serous ovarian cancer tissues by GSEA

2.3 CXCL9 mRNA表達(dá)與CD8A及免疫檢查點mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析

運用Pearson相關(guān)分析對TCGA漿液性卵巢癌腫瘤組織中CXCL9與CD8A、PD-L1、PD-1及CTLA4mRNA表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析，其中R代表Pearson相關(guān)系數(shù)，表示兩者mRNA間的線性關(guān)系（即最大正相關(guān)為1、最大負(fù)相關(guān)為-1）。結(jié)果（圖4）顯示，CD8A、PD-L1、PD-1及CTLA4mRNA均與CXCL9mRNA表達(dá)存在顯著的線性正相關(guān)（均P＜0.05），其中CTLA4、CD8A、PD-1的表達(dá)分別與CXCL9表達(dá)的線性相關(guān)系數(shù)均較高（R＞0.7）。

圖4 CXCL9與CD8A、CTLA4、PD-1及PD-L1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析Fig 4 Correlation of mRNA expression levels of CXCL9 and CD8A, CTLA4, PD-1 and PD-L1

3 討論

過往研究已證實卵巢癌是一種免疫原性腫瘤，該腫瘤組織中的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞數(shù)目與患者的預(yù)后呈正相關(guān)。除腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞數(shù)目外，腫瘤微環(huán)境中免疫效應(yīng)細(xì)胞與抑制細(xì)胞的比例、免疫細(xì)胞浸潤位置及免疫細(xì)胞激活程度也是影響該患者預(yù)后及臨床免疫治療應(yīng)答的重要因素。趨化因子CXCL9的表達(dá)與腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞遷移、分化及激活密切相關(guān)，且對表達(dá)CXCR3的CD8+T細(xì)胞、Th1細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NK細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)具有積極影響[9-11]。

研究[16-17]顯示，CXCL9的高度表達(dá)與腎癌、胰腺導(dǎo)管腺癌等多種惡性腫瘤的總體生存期延長相關(guān)。有研究[16]使用免疫組織化學(xué)技術(shù)（免疫組化）對CXCL9在腎癌組織中的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCL9的表達(dá)量與腫瘤大小、腫瘤微血管密度均呈負(fù)相關(guān)，與CD8+T細(xì)胞在腫瘤中的浸潤數(shù)量呈正相關(guān)。Bronger等[18]對184例高級別漿液性卵巢癌的CXCL9、CXCL10表達(dá)進(jìn)行免疫組化分析，并使用CD3、CD56和FOXP3熒光抗體標(biāo)記細(xì)胞以評估腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的數(shù)量；結(jié)果表明，CXCL9高表達(dá)是晚期高級別漿液性卵巢癌的有利預(yù)后因素，并推測CXCL9對腫瘤抑制性免疫細(xì)胞的趨化性募集可能是導(dǎo)致卵巢癌預(yù)后良好的原因。本研究中，我們根據(jù)TCGA漿液性卵巢癌數(shù)據(jù)集中CXCL9mRNA的TPM中位數(shù)將TCGA數(shù)據(jù)集分為CXCL9低表達(dá)組和CXCL9高表達(dá)組，并通過Kaplan-Meier法對2組的總體生存期進(jìn)行分析，結(jié)果顯示CXCL9高表達(dá)組與預(yù)后良好顯著相關(guān)。為進(jìn)一步擴大樣本量、減少抽樣誤差，本研究對16組研究的樣本表達(dá)譜及患者生存數(shù)據(jù)中CXCL9mRNA表達(dá)與總體生存期間的關(guān)系進(jìn)行綜合分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其表達(dá)亦與卵巢癌預(yù)后良好顯著相關(guān)。

目前，卵巢癌的死亡率位居婦科惡性腫瘤之首，且其患者總體生存期在過去30年間并沒有得到顯著提升，而以鉑類及紫杉醇類藥物為基礎(chǔ)的化療方式也一直未得到有效突破，因此急需探索除傳統(tǒng)化療之外的治療方法，如免疫治療。迄今已有多個臨床試驗證實，PD-1單抗在黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌等多種腫瘤中具有顯著的臨床效果，而在卵巢癌中使用PD-1單抗單藥治療的客觀緩解率較低（為10%～15%）。因此，探索預(yù)測卵巢癌PD-1/PD-L1阻斷治療的生物標(biāo)志物以有效篩選潛在獲益人群，成為了研究者們的共識。截至目前，大量研究已發(fā)現(xiàn)多種因素可影響PD-1單抗的藥物有效性，包括腫瘤微環(huán)境中抗腫瘤免疫細(xì)胞浸潤的數(shù)量與位置[19]、腫瘤負(fù)荷[20]、PD-L1表達(dá)水平[21]、抗原提呈缺陷[22]、干擾素信號傳導(dǎo)[23]及錯配修復(fù)缺陷[24]等。腫瘤組織PD-L1表達(dá)是目前應(yīng)用范圍最廣的免疫檢查點抑制劑生物標(biāo)志物，但就卵巢癌而言，即便是PD-L1陽性表達(dá)的人群，其對PD-1單抗的應(yīng)答率依然較低。KEYNOTE-028臨床試驗[25]是一項關(guān)于PD-1單抗pembrolizumab的一期臨床試驗，該試驗共納入26例PD-L1陽性（PD-L1表達(dá)≥1%）的晚期卵巢癌患者，患者每2周接受1次pembrolizumab治療（10 mg/kg），持續(xù)24個月；結(jié)果顯示，其最終客觀緩解率為11.5%（1例完全緩解、2例局部緩解），中位無進(jìn)展生存期及中位生存期分別為1.9個月和13.8個月。為進(jìn)一步探究pembrolizumab在晚期卵巢癌患者中的療效，KEYNOTE-100臨床試驗[26]中入組376例復(fù)發(fā)性晚期卵巢癌患者，每3周接受1次pembrolizumab靜脈注射（200 mg）；截至目前，該試驗中總?cè)巳旱目陀^緩解率僅為8%，其中PD-L1表達(dá)聯(lián)合陽性評分（combined positive score，CPS） ＜1的患者的客觀緩解率僅為5.0%，而CPS≥1（或CPS≥10）的患者的客觀緩解率也同樣較低，分別為10.2%（或17.1%）。該研究一方面提示在卵巢癌中PD-L1的表達(dá)水平與pembrolizumab療效具有一定的相關(guān)性，即PD-L1表達(dá)評分高的患者，采用pembrolizumab治療具有相對更高的客觀緩解率；另一方面亦提示即使將PD-L1表達(dá)CPS≥10作為篩選患者的陽性閾值，該人群的客觀緩解率依然不高。因此，在卵巢癌中為進(jìn)一步精準(zhǔn)篩選PD-1/PD-L1阻斷治療潛在獲益人群，急需探索其他生物標(biāo)志物以更有效篩選患者。

綜上所述，在卵巢癌PD-1/PD-L1阻斷治療中，除進(jìn)一步完善PD-L1等生物標(biāo)志物的應(yīng)用外，探索其他預(yù)測PD-1/PD-L1阻斷治療的生物標(biāo)志物，或?qū)ふ倚碌纳飿?biāo)志物與已有標(biāo)志物聯(lián)合使用成為了當(dāng)下亟待解決的問題。本研究中，我們通過GSEA研究發(fā)現(xiàn)CXCL9mRNA主要富集于細(xì)胞因子及其受體相互作用通路、NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性通路、JAK-STAT信號通路、白細(xì)胞跨膜通路、T細(xì)胞受體信號通路以及抗原加工與提呈通路等。這些通路均參與了腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞遷移、分化及激活等重要的抗腫瘤免疫生物學(xué)功能，繼而提示CXCL9在卵巢癌抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮著多重效應(yīng)；此外，本研究通過Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，CXCL9mRNA表達(dá)與CD8A及免疫檢查點mRNA表達(dá)呈正相關(guān)。目前研究[27]認(rèn)為腫瘤微環(huán)境中PD-L1、PD-1等免疫檢查點mRNA表達(dá)主要受與JAKSTAT通路相關(guān)的IFN-γ下游調(diào)節(jié)，而CXCL9是IFN-γ誘導(dǎo)產(chǎn)生的趨化因子，因此CXCL9與免疫檢查點的mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)可能與其兩者皆受IFN-γ調(diào)控相關(guān)。根據(jù)以上結(jié)果推測，在CXCL9高表達(dá)組的免疫微環(huán)境中或存在高表達(dá)的CD8+T細(xì)胞及PD-L1。Teng等[28]針對免疫治療提出了一種腫瘤微環(huán)境的免疫分型（tumor microenvironment immune type，TMIT），該分型基于腫瘤PD-L1表達(dá)及腫瘤淋巴細(xì)胞浸潤（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）情況將腫瘤分成4型，包括Ⅰ型TIL+PD-L1+（適應(yīng)性免疫抵抗型）、Ⅱ型TIL+PD-L1-（免疫豁免型）、Ⅲ型TIL-PD-L1+（內(nèi)源誘導(dǎo)型）和Ⅳ型TIL-PD-L1-（免疫耐受型）。由于PD-L1與TIL雙陽性是免疫檢查點通路參與腫瘤內(nèi)浸潤T細(xì)胞程序化死亡的最有力證據(jù)，使得Ⅰ型腫瘤被認(rèn)為是最有可能受益于PD-1/PD-L1阻斷治療的分型。Kryczek等[29]研究顯示，CXCL9表達(dá)與CD8+T細(xì)胞浸潤顯著相關(guān)；且表達(dá)CXCR3的免疫細(xì)胞（如NK細(xì)胞[11]、Th1細(xì)胞[30]）也均被證明，其可通過CXCR3依賴的方式被CXCL9-CXCR3軸募集到腫瘤所在部位。綜合上述研究可以推斷，本研究中的CXCL9高表達(dá)組卵巢癌組織或存在Ⅰ型（TIL+PD-L1+）腫瘤免疫微環(huán)境，繼而受益于PD-1/PD-L1阻斷治療。

卵巢癌錯綜復(fù)雜的基因組表達(dá)變化與其腫瘤微環(huán)境之間的相互作用是研究卵巢癌免疫檢查點抑制劑的巨大挑戰(zhàn)，這不僅涉及免疫細(xì)胞還涉及腫瘤微環(huán)境中眾多免疫趨化因子在免疫激活通路中發(fā)揮的動態(tài)作用。近期，越來越多的研究強調(diào)趨化因子CXCL9對腫瘤患者生存的影響及其在腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫細(xì)胞的遷移、浸潤功能。CXCL9作為調(diào)控免疫細(xì)胞浸潤的重要基因，在卵巢癌免疫微環(huán)境中參與了多項抗腫瘤免疫應(yīng)答，與較高的免疫細(xì)胞浸潤數(shù)量相關(guān)，且與PD-L1的表達(dá)呈正相關(guān)。未來，CXCL9或可作為預(yù)測卵巢癌患者響應(yīng)PD-1/PD-L1阻斷治療的生物標(biāo)志物之一，同時將CXCL9與PD-L1表達(dá)或錯配修復(fù)缺陷聯(lián)合使用，或有望更精準(zhǔn)地篩選PD-1/PD-L1阻斷治療的潛在獲益患者。