劉健悅 ,沈 蕾
1.上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與微生物學(xué)系,上海200025;2.上海市免疫學(xué)研究所,上海200025
3型固有淋巴細(xì)胞(group 3 innate lymphoid cell,ILC3)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類重要的免疫細(xì)胞亞群,主要富集在腸道黏膜組織,表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子視黃酸受體相關(guān)的孤兒核受體(retinoic acid receptor related orphan receptor,RORγt),并分泌細(xì)胞因子白細(xì)胞介素22(interleukin-22,IL-22)和IL-17[1-3]。ILC3表面缺乏抗原特異性受體的表達(dá),在腸道中主要受細(xì)胞因子IL-23/IL-1β調(diào)控激活,在維持黏膜屏障完整性和抗病原體感染過程中發(fā)揮著重要作用[4-5]。研究[6]表明,ILC3功能缺失或低下可導(dǎo)致腸道細(xì)菌感染。在小鼠中,ILC3可基于細(xì)胞表面標(biāo)志物趨化因子受體6(C-C motif chemokine receptor 6,CCR6)和天然細(xì)胞毒性受體(natural cytotoxicity triggering receptor,NCR,又稱NKp46)的差異表達(dá)劃分為不同亞群[7]。其中,CCR6+NKp46-ILC3是腸道淋巴組織發(fā)育所需的,可分泌IL-22和IL-17A;而共表達(dá)RORγt和T-bet(T-box transcription factor 21)的CCR6-NKp46+ILC3和CCR6-NKp46-ILC3主要分泌IL-22[8-9]。IL-22對(duì)于組織修復(fù)和宿主腸道組織抗細(xì)菌感染至關(guān)重要。一方面,IL-22信號(hào)可促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞間緊密連接的形成以及傷口愈合;另一方面,IL-22還調(diào)控與抗菌肽形成有關(guān)的基因表達(dá)以及上皮細(xì)胞的巖藻糖基化[10-13]。近年來,對(duì)ILC3發(fā)育和功能的研究越來越多,揭示了其在機(jī)體免疫中的重要性;但作為新興領(lǐng)域,仍有許多問題需要解決,關(guān)于ILC3穩(wěn)態(tài)及功能調(diào)節(jié)的相關(guān)研究仍具有重要意義。
雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin kinase,mTOR)是一種進(jìn)化上高度保守的非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,屬于磷酸肌醇-3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase,PI3K)相關(guān)激酶家族,主要以2種復(fù)合體mTORC1(mTOR complex 1)和mTORC2的形式存在[14-15]。其中,關(guān)于mTORC1活化和功能的研究更為廣泛和透徹,其可整合生長(zhǎng)因子、壓力、能量狀態(tài)及氧氣等多種胞內(nèi)外信號(hào),調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和自噬等過程。mTORC1主要由Raptor(regulatory associated protein of mTOR)、mLST8(mTOR associated protein)、PRAS40(proline-rich Akt substrate 40 kDa)、DEPTOR(DEP domain containing mTOR interacting protein)以及mTOR分子組成,對(duì)雷帕霉素反應(yīng)敏感[16-18]。越來越多的研究表明mTORC1對(duì)免疫細(xì)胞的發(fā)育和功能起著重要的調(diào)控作用。mTORC1可以通過影響轉(zhuǎn)錄因子STAT(signal transducer and activator of transcription)家族成員從而決定CD4+T細(xì)胞的譜系分化,如Yang等[19]發(fā)現(xiàn)mTORC1的重要組分Raptor缺失后會(huì)導(dǎo)致Th2和Th17細(xì)胞分化受損,但不影響Th1細(xì)胞的分化。mTORC1還可通過作用于缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor 1,HIF1)和干擾素調(diào)節(jié)因子4(interferon regulatory factor 4,IRF4)促進(jìn)CD8+效應(yīng)T細(xì)胞的分化和功能[20]。在B細(xì)胞中,有研究[21]發(fā)現(xiàn)mTORC1功能被抑制后,B細(xì)胞增殖和漿細(xì)胞分化減弱,體液免疫應(yīng)答受損。此外,mTORC1還參與調(diào)節(jié)IL-23誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞中IL-22和IL-17的產(chǎn)生[22]。然而目前為止,關(guān)于mTORC1對(duì)固有淋巴細(xì)胞調(diào)控的研究仍很少。鑒于固有淋巴細(xì)胞與T細(xì)胞之間的相似性,我們推測(cè)mTORC1在ILC3的發(fā)育維持和功能調(diào)控中也起著重要作用。
本研究先通過體外的雷帕霉素(rapamycin)抑制實(shí)驗(yàn)探究mTORC1對(duì)ILC3功能的調(diào)控作用,然后構(gòu)建ILC3特異性mTORC1功能缺失的條件性敲除小鼠,檢測(cè)該小鼠腸道ILC3發(fā)育及功能的變化情況。
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究中所有小鼠均為C57BL/6背景,Rptorflox/floxRorcCre(Rptor為編碼Raptor蛋白的基因,Rorc為編碼RORγt蛋白的基因)小鼠由Rptorflox/flox小鼠和Rorccre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交獲得,其中Rptorflox/flox小鼠受贈(zèng)于中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)葉麗林教授課題組,Rorc-cre轉(zhuǎn)基因小鼠受贈(zèng)于中國(guó)科學(xué)院上海營(yíng)養(yǎng)與健康研究所邱菊教授實(shí)驗(yàn)室。野生型C57BL/6小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。所有實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部的SPF級(jí)設(shè)施中,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證為SYXK(滬)2018-0027。除非本文另有說明,否則實(shí)驗(yàn)用小鼠均為同窩6~8周齡雌鼠。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)批準(zhǔn)。
1.1.2 主要試劑與儀器抗CD3、CD45R(B220)、CD11b、CD11c、Ly-6G(lymphocyte antigen 6 complex,locus G)、CD45.2和IL-22的抗體均購自BioLegend公司(美國(guó)),抗RORγt、NK1.1(CD161)和CD90.2抗體購自eBioscience公司(美國(guó)),抗殺傷細(xì)胞凝集素樣受體G1(killer cell lectin like receptor G1,KLRG1)抗體購自BD Biosciences公司(美國(guó)),蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑Brefeldin A和細(xì)胞破膜固定液購自Thermo Fisher公司(美國(guó)),DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司(美國(guó)),膠原酶Ⅷ和脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)購自Sigma Aldrich公司(美國(guó))。另有試劑IL-23(R&D Systems,美國(guó))、雷帕霉素(Selleck Chemicals,美國(guó))、小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞染色試劑盒(eBioscience,美國(guó))、PrimeScript RT試劑盒(TaKaRa,日本)、SYBR Green核酸熒光染料(Applied Biosystems,美國(guó))。實(shí)驗(yàn)中所用到的儀器主要有BD FACSAriaTMⅢ流式分選儀(BD Biosciences,美國(guó))、BD LSRFortessaTMX-20流式分析儀(BD Biosciences,美國(guó) )、7500 Fast Real-time PCR儀(Applied Biosystems,美國(guó))。
1.2.1 小鼠腸道固有層淋巴細(xì)胞的分離 小鼠脫頸處死后取出腸道,剝除上面附著的脂肪,剪去派氏結(jié)(Peyer′s patch),沿縱向剪開,放入磷酸鹽緩沖液(PBS)中震蕩清洗,去除糞便。之后剪成1~2 cm的小段,先放入含有1 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)的PBS中震蕩10 min,再轉(zhuǎn)移到含30 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)和10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)的10 mL PBS中震蕩10 min。然后用含有0.05% DNaseⅠ和100 U/mL膠原酶Ⅷ的4 mL RPMI 1640培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)90 min。消化結(jié)束后劇烈晃動(dòng)使組織細(xì)胞分散并用孔徑100 μm的細(xì)胞過濾器過濾,然后在室溫下以500×g離心20 min,從80%和40%Percoll梯度液的中間層收獲單個(gè)核細(xì)胞,得到腸道固有層淋巴細(xì)胞(lamina propria leukocyte,LPL)。
1.2.2 流式染色 得到的腸道LPL先按1:100加入Fc端封閉劑(CD16/32),4 ℃孵育10 min。細(xì)胞表面蛋白如CD3、CCR6、CD11b、CD45、CD11c等的染色按1:200比例稀釋抗體,4 ℃避光孵育30 min,然后PBS洗去抗體。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)部蛋白如IL-22及核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子如RORγt的染色,先用小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞染色試劑盒將細(xì)胞固定透化1 h,再按1:100比例稀釋胞內(nèi)抗體,4 ℃避光孵育1 h,PBS洗去抗體,最后用200 μL PBS重懸細(xì)胞。過程中離心程序均為400×g,5 min。
1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分選獲得的細(xì)胞先用TRIzol試劑抽提出RNA,檢測(cè)RNA濃度,并用PrimeScript RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green試劑盒和不同的引物組進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time qPCR),每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,檢測(cè)程序?yàn)?5 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃1 min,95 ℃ 15 s,40個(gè)循環(huán);60 ℃ 1 min。結(jié)果是相對(duì)于次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthine phosphoribosyl transferase,Hprt)基因標(biāo)準(zhǔn)化的相對(duì)表達(dá)值,并根據(jù)2-ΔΔCT方法統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)中所用到的引物序列見表1。
表1 Real-time qPCR引物Tab 1 Primer sequences for real-time qPCR
本實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,定量資料用±s表示;2組間差異的比較采用非配對(duì)Student′st檢驗(yàn)計(jì)算。統(tǒng)計(jì)圖中所用樣本數(shù)據(jù)均來源于2個(gè)及以上獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
雷帕霉素是mTORC1信號(hào)通路的特異性抑制劑,對(duì)野生型C57BL/6小鼠腸道LPL用雷帕霉素體外刺激6 h,流式細(xì)胞分析檢測(cè)ILC3數(shù)量(RORγt+細(xì)胞)及IL-22的分泌情況。結(jié)果顯示0.1 mg/mL雷帕霉素處理后,ILC3比例及數(shù)量無變化,但分泌的IL-22明顯減少(圖1);圖中也可觀察到RORγt陰性的非ILC3細(xì)胞IL-22產(chǎn)生能力不受影響,這提示mTORC1對(duì)ILC3功能具有調(diào)控作用。
圖1 雷帕霉素對(duì)ILC3分泌IL-22的抑制作用Fig 1 Inhibitory effect of rapamycin on IL-22 secretion of ILC3
上述rapamycin刺激LPL實(shí)驗(yàn)中,無法排除LPL中其他淋巴細(xì)胞對(duì)ILC3的干擾作用。故取6~8周齡野生型小鼠腸道LPL,借助流式分選技術(shù)獲取純化的ILC3。小鼠腸道ILC3的分選策略為:首先借助側(cè)向散射光(side scatter,SSC)去除成團(tuán)的細(xì)胞,然后根據(jù)前向散射光(forward scatter,F(xiàn)SC)和SSC確定淋巴細(xì)胞亞群的位置,再利用譜系標(biāo)記(lineage marker)(CD3、B220、CD11b、CD11c、Ly-6G)定義出Lin-淋巴細(xì)胞群,之后通過CD45.2和CD90.2圈出CD45.2lowCD90.2high細(xì)胞群,ILC3主要集中在這一群中,最后使用KLRG1和NK1.1排除其中少量的ILC2及ILC1,得到純化的ILC3(圖2A)。對(duì)分選獲得的ILC3進(jìn)行RORγt表達(dá)水平的回測(cè),結(jié)果證實(shí)分選得到的ILC3中RORγt陽性的比例達(dá)到90%以上(圖2B)。
IL-23是激活I(lǐng)LC3的主要上游信號(hào),活化后的ILC3可分泌更多的IL-22等細(xì)胞因子,調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)。將利用上述方法分選出來的ILC3用10 ng/mL IL-23刺激24 h,然后通過real-time qPCR檢測(cè)Rorc和Il22的mRNA表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)與已有的研究結(jié)果一致,這2種基因的mRNA表達(dá)均上調(diào)。結(jié)果還顯示,mTORC1的關(guān)鍵組成蛋白R(shí)aptor的mRNA表達(dá)水平也同步上調(diào)(圖2C)。上述結(jié)果提示,mTORC1可能在ILC3分泌IL-22的過程中起調(diào)控作用。
圖2 ILC3的純化及IL-23對(duì)其Rorc、Il22和Rptor mRNA表達(dá)的影響Fig 2 Purification of ILC3 and effect of IL-23 on Rorc, Il22 and Rptor mRNA expression
為了進(jìn)一步探究mTORC1在小鼠腸道ILC3中的作用,用Rptorflox/flox小鼠(下文簡(jiǎn)稱為WT小鼠)與Rorc-cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交,從而獲得只在表達(dá)RORγt的細(xì)胞中特異性敲除Rptor基因的小鼠Rptorflox/floxRorcCre(下文簡(jiǎn)稱為KO小鼠),該小鼠是研究mTORC1功能缺失常用的工具小鼠。首先用real-time qPCR驗(yàn)證Rptor的敲除效率,KO小鼠ILC3中RptormRNA表達(dá)水平顯著降低,說明條件性敲除小鼠構(gòu)建成功(圖3A)。
借助流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)一步分析小鼠結(jié)腸ILC3及ILC3中各亞群的比例及數(shù)量,發(fā)現(xiàn)WT小鼠和KO小鼠之間并無明顯差異(圖3B、C)。隨后,又比較了穩(wěn)態(tài)下WT小鼠和KO小鼠小腸及結(jié)腸長(zhǎng)度和腸道派氏結(jié)的數(shù)量,仍無明顯差異(圖3D、E)。最后,通過蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,H-E染色)對(duì)比了WT小鼠和KO小鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示特異性敲除Rptor后并未使穩(wěn)態(tài)下腸道結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變(圖3F)。
圖3 KO小鼠與WT小鼠ILC3及ILC3中各亞群的比例及數(shù)量和腸道結(jié)構(gòu)觀察Fig 3 Ratios and numbers of ILC3 and ILC3 subsets and observation of intestinal structure in KO mice and WT mice
鑒于上述KO小鼠結(jié)腸的ILC3數(shù)量沒有發(fā)生變化,后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了KO小鼠結(jié)腸ILC3活化后分泌細(xì)胞因子的能力是否發(fā)生改變。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示,在使用1 ng/mL IL-23刺激8 h后,相比WT小鼠,KO小鼠分泌IL-22的量顯著減少(圖4A),但分泌粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor,GMCSF)的能力不變(圖4B)。相應(yīng)地,在分選出WT小鼠和KO小鼠腸道ILC3后,使用1 ng/mL的IL-23刺激8 h,通過real-time qPCR檢測(cè)Il22mRNA及編碼GM-CSF的基因Csf2mRNA水平,結(jié)果與流式細(xì)胞分析結(jié)果一致(圖4C)。
圖4 Raptor缺失后ILC3分泌IL-22的能力Fig 4 Ability of ILC3 to secrete IL-22 after Raptor-deficiency
腸道免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的維持依賴于分布在腸黏膜上皮和固有層的各類免疫細(xì)胞協(xié)同作用。ILC3是近年來發(fā)現(xiàn)的一類免疫細(xì)胞亞群,主要富集于腸道黏膜組織,在腸道免疫穩(wěn)態(tài)和微生物防御中發(fā)揮重要作用[1-2]。在腸道生理穩(wěn)態(tài)下,共生微生物來源的相關(guān)信號(hào)首先促使巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等分泌IL-23和IL-1β,兩者作為ILC3的主要上游信號(hào),可使ILC3活化并分泌細(xì)胞因子IL-22和IL-17A等;其中,IL-22被認(rèn)為對(duì)腸道屏障穩(wěn)態(tài)起著正向調(diào)控作用。IL-22主要參與促進(jìn)上皮細(xì)胞抗菌肽及黏液的生成、上皮細(xì)胞增殖和巖藻糖基化以及組織修復(fù)等過程,從而維持腸道屏障穩(wěn)態(tài)[10-12]。研究[8]表明,ILC3中IL-22分泌缺失或低下可導(dǎo)致腸道細(xì)菌感染。ILC3和輔助性T細(xì)胞(Th17、Th22)均可產(chǎn)生IL22,但I(xiàn)LC3已被證實(shí)是腸道穩(wěn)態(tài)下IL-22的主要來源。關(guān)于ILC3中IL-22分泌的調(diào)控已有報(bào)道,主要集中在轉(zhuǎn)錄水平,如芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor,Ahr)及轉(zhuǎn)錄因子STAT3等都參與誘導(dǎo)IL-22的生成[23-24],但仍存在很多未知的調(diào)控機(jī)制。
本研究先借助體外雷帕霉素刺激LPL實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)mTORC1對(duì)ILC3功能具有調(diào)控作用,又在IL-23刺激ILC3活化過程中觀察到編碼IL-22和mTORC1關(guān)鍵組分蛋白R(shí)aptor的基因mRNA表達(dá)水平同步上調(diào),猜測(cè)mTORC1可能參與調(diào)控ILC3中IL-22的生成。通過構(gòu)建Rptorflox/floxRorcCre特異性基因敲除小鼠,發(fā)現(xiàn)ILC3缺失Raptor后其分泌IL-22的能力受損,但并未影響小鼠結(jié)腸ILC3及ILC3亞群的數(shù)量,這說明mTORC1調(diào)控了ILC3的功能,但并未影響ILC3的發(fā)育。同時(shí)腸道穩(wěn)態(tài)下在KO小鼠中未觀察到腸道結(jié)構(gòu)損傷,這可能是由于腸道穩(wěn)態(tài)下IL-22分泌減少后機(jī)體內(nèi)存在其他代償機(jī)制。
綜上,本研究主要發(fā)現(xiàn)mTORC1功能缺失后導(dǎo)致ILC3分泌IL-22能力下降,鑒于IL-22在腸道抗微生物感染中的重要作用,提示mTORC1可能參與腸道穩(wěn)態(tài)維持和抗感染的過程。后續(xù)我們將通過鼠類檸檬酸菌感染模型進(jìn)一步驗(yàn)證。另外,已有研究[25]發(fā)現(xiàn)mTOR依賴性的糖酵解等代謝程序調(diào)控了Th17細(xì)胞的增殖和效應(yīng)功能。鑒于ILC3和Th17細(xì)胞之間的相似性,mTORC1對(duì)ILC3功能的調(diào)控是否也通過相關(guān)代謝通路仍需進(jìn)一步探究。
上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)2020年4期