張振忠 ,岳壽松,陳 靚,滕素玲,孫培錄,王 燕,李 軍 *

（1.濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250200；2.山東第一醫(yī)科大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥物研究所，山東 濟(jì)南 250062；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250100；4.國(guó)家衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省罕少見(jiàn)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250062）

環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）是最常用的烷化劑類(lèi)抗腫瘤藥物之一[1]，同多種化療藥物一樣在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)還對(duì)患者產(chǎn)生毒副作用尤其是對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抑制，這是困擾其在腫瘤化療中應(yīng)用的難題[2]。探尋改善化療藥物的毒副作用、提高機(jī)體免疫措施一直是人們關(guān)注的重點(diǎn)。乳酸菌作為公認(rèn)的益生菌，已在食品及醫(yī)藥行業(yè)中廣泛應(yīng)用，已有研究顯示其可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，進(jìn)一步提高機(jī)體抗腫瘤能力[3]。因此深入研究乳酸菌對(duì)免疫活性的影響具有重要臨床意義。本研究選用3種乳酸菌菌株配比形成的復(fù)合制劑，研究其對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫低下大鼠模型的免疫調(diào)節(jié)作用，以期為腫瘤化療探尋新的輔助干預(yù)措施。

1 儀器與材料

1.1 儀器

YP3001N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；SL3001N型電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；LDZ5-2低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）；J-25型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；XT-2000iv自動(dòng)血球分析儀（日本希森美康東亞株式會(huì)社）；Infinite M200 PRO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（法國(guó)TECAN公司）；BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；CFX96 Touch熒光定量PCR儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）。

1.2 試劑

乳酸菌制劑由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心微生物研究室制備。將嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）SD65、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）SD07和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）SD02分別活化、液體培養(yǎng)，收集菌體，生理鹽水懸浮菌體成109CFU/ml，等比例混合制得；注射用環(huán)磷酰胺（CTX，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司，規(guī)格：0.2 g/支）；血液學(xué)質(zhì)控品（Sysmex Corporation）；血液學(xué)檢測(cè)試劑盒[Sysmex Corporation及希森美康生物科技（無(wú)錫）有限公司]；流式細(xì)胞檢測(cè)CD4、CD8抗體（Ebioscience公司生產(chǎn)）；SYBR GreenqPCR Master mix（日本TOYOBO公司）；TRIzol?試劑（Thermo Fisher Scientific）；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Sprague-Dawley（SD）大鼠，SPF級(jí)，雄性，體重260～316 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）2014 0007。動(dòng)物飼養(yǎng)于山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所普通動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（魯）2017 0003。試驗(yàn)方案通過(guò)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組與給藥

雄性SD大鼠50只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、乳酸菌制劑1.25，2.5，5 ml/kg 3個(gè)劑量組，每組10只。除正常對(duì)照組外，各組動(dòng)物于第1，5，8，15，22天腹腔注射10 mg/ml的CTX，給藥體積4 ml/kg；正常對(duì)照組注射等體積生理鹽水。同時(shí)從第1天開(kāi)始，乳酸菌制劑組灌胃給予乳酸菌制劑原液1.25，2.5，5.0 ml/kg，模型組和正常對(duì)照組給予等容積的動(dòng)物飲用水，灌胃前分別以動(dòng)物飲用水補(bǔ)足5.0 ml/kg。

2.2 指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 動(dòng)物體重測(cè)量 分別于動(dòng)物開(kāi)始給藥后每隔1周左右稱量體重。試驗(yàn)結(jié)束剖檢稱量動(dòng)物臟器重、計(jì)算臟器系數(shù)。

2.2.2 血常規(guī)指標(biāo)檢測(cè) 動(dòng)物禁食不禁水12～15 h，采抗凝血，測(cè)定白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比率和淋巴細(xì)胞比率。

2.2.3 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 取抗凝全血100 μl，流式細(xì)胞儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群。

2.2.4 血清白介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平檢測(cè) 取血清，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)IL-6和TNF-α水平。

2.2.5 脾臟IL-2、IL-6及TNF-α基因表達(dá)水平檢測(cè)摘取脾臟液氮凍存，采用TRIzol?試劑提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)脾臟IL-2、IL-6以及TNF-α基因表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)所需各基因的引物序列見(jiàn)表1。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)差（±s）表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 乳酸菌制劑對(duì)大鼠生長(zhǎng)的影響

CTX模型組大鼠在灌胃給藥的第7天～藥后27天，動(dòng)物體重增重緩慢，體重顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.01或P＜0.05）。乳酸菌制劑干預(yù)后第7天～藥后27天動(dòng)物體重高于CTX模型組（P＜0.01或P＜0.05），且作用呈劑量相關(guān)性。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因的引物序列

表2 乳酸菌制劑對(duì)大鼠體重增長(zhǎng)的影響（n=10）

3.2 乳酸菌制劑對(duì)大鼠胸腺和脾臟系數(shù)的影響

結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，CTX模型組大鼠的胸腺指數(shù)顯著低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明CTX有較強(qiáng)的免疫抑制毒性。乳酸菌制劑5 ml/kg組大鼠胸腺指數(shù)高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。乳酸菌制劑2.5，5 ml/kg組大鼠脾臟指數(shù)高于模型對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表3 乳酸菌制劑對(duì)胸腺和脾臟指數(shù)的影響（n=10）

3.3 乳酸菌制劑對(duì)大鼠部分免疫細(xì)胞的影響

結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn)，CTX模型組大鼠的白細(xì)胞數(shù)目、淋巴細(xì)胞數(shù)目均低于正常對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。乳酸菌制劑高劑量組白細(xì)胞數(shù)目高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；乳酸菌制劑低、中、高劑量組CD4/CD8均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表4 乳酸菌制劑對(duì)大鼠部分固有免疫細(xì)胞及CD4/CD8的影響（n=10）

3.4 乳酸菌制劑對(duì)大鼠血清IL-6、TNF-α含量的影響

結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可見(jiàn)，模型組大鼠血清IL-6含量低于正常對(duì)照組（P＜0.05），TNF-α含量高于正常對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01）。乳酸菌制劑2.5，5.0 ml/kg劑量組血清IL-6含量顯著高于模型組（P＜0.05）；乳酸菌制劑1.25，2.5，5.0 ml/kg劑量組血清TNF-α含量顯著低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。

表5 乳酸菌制劑對(duì)大鼠血清IL-6、TNF-α含量（n=10）

3.5 乳酸菌制劑對(duì)大鼠IL-2、IL-6以及TNF-α基因表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)大鼠脾臟相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖1。模型組大鼠的IL-2和IL-6的表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.05），模型組的TNF-α表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。乳酸菌制劑2.5，5.0 ml/kg干預(yù)組IL-2基因表達(dá)水平高于模型組（P＜0.05），2.5 ml/kg干預(yù)組IL-6基因表達(dá)水平高于模型組（P＜0.05），作用呈劑量依賴性。乳酸菌制劑高劑量組的TNF-α基因表達(dá)水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

4 討論

CTX作為抗腫瘤藥物，主要用于惡性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、白血病、乳腺癌等的治療[1,4-5]。它代謝生成的丙烯醛可產(chǎn)生膀胱炎、血尿等一系列尿毒性癥狀[6]。CTX還能殺傷免疫細(xì)胞，進(jìn)而影響免疫的各階段，嚴(yán)重干擾人的正常免疫功能。本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[2]方法并略作改進(jìn)，大鼠腹腔注射40 mg/kg CTX 5次后，大鼠的體重增長(zhǎng)顯著滯后于正常對(duì)照組、免疫器官萎縮變小，免疫細(xì)胞數(shù)量減少，刺激免疫應(yīng)答的IL-2、IL-6含量降低，損傷相關(guān)因子TNF-α的含量顯著增加。由此可見(jiàn)應(yīng)用CTX腹腔注射大鼠可對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生較全面的毒性作用，特別是造成大鼠免疫功能低下的狀態(tài)。此模型可用于觀察不同劑量的乳酸菌制劑對(duì)大鼠損傷及免疫功能的影響。

圖1 乳酸菌制劑對(duì)大鼠IL-2、IL-6及TNF-α基因表達(dá)的影響

免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫活性物質(zhì)組成，機(jī)體免疫應(yīng)答可分為固有性免疫（先天性免疫或非特異性免疫）和適應(yīng)性免疫（獲得性免疫或特異性免疫）兩大類(lèi)，執(zhí)行機(jī)體免疫監(jiān)視、防御、調(diào)控等功能。機(jī)體紊亂或者環(huán)境、藥物、治療等引起的免疫系統(tǒng)任一方面異常都可能引起免疫功能的障礙[7]。腫瘤發(fā)生過(guò)程的初期免疫機(jī)能失衡，同時(shí)又由于化療過(guò)程中化療藥物對(duì)免疫系統(tǒng)的損傷，進(jìn)一步影響機(jī)體的免疫機(jī)能，降低了機(jī)體對(duì)腫瘤的自我抵抗能力。已有研究顯示乳酸菌可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，提高機(jī)體抗腫瘤能力[3]。篩選化療損傷狀態(tài)下提高人休免疫活性的乳酸菌菌株，研究乳酸菌對(duì)CTX等化療藥物損傷免疫應(yīng)答不同時(shí)期干預(yù)作用的效果及機(jī)制有重要的臨床意義。

本研究以3種乳酸菌制得的口服制劑為研究對(duì)象，研究其對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果表明乳酸菌復(fù)合制劑可明顯提高CTX所致免疫低下大鼠的免疫功能，有望在臨床上應(yīng)用于化療免疫低下病人的輔助治療。