任 明，孫 榮，劉建民

（山東惠仕萊生物科技有限公司，山東 濟(jì)南 250101）

甲萘醌-7（MK-7）是生物活性最高的一種維生素K2，可通過調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣離子沉積，促進(jìn)骨組織內(nèi)骨鈣素的合成，預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥[1]。天然MK-7僅能通過微生物發(fā)酵法獲得[2]，其中，納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)速度快、易于培養(yǎng)、MK-7含量相對(duì)高，是目前進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)MK-7的主要微生物。但野生型的納豆芽孢桿菌的MK-7產(chǎn)量不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求，需通過誘變育種獲得目的產(chǎn)物產(chǎn)量更高的突變株。

目前，紫外誘變（UV）仍是實(shí)驗(yàn)室最常用的菌種誘變方法，但長(zhǎng)時(shí)期采用單一誘變會(huì)導(dǎo)致菌種產(chǎn)生疲勞效應(yīng)，還會(huì)因?yàn)榉磸?fù)誘變處理使得生物量降低、產(chǎn)物含量減少。因此，多種方式復(fù)合誘變提高誘變效果和產(chǎn)量是近年的研究熱點(diǎn)。常壓室溫等離子體誘變（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）是利用在大氣壓下產(chǎn)生的，溫度在25～40 ℃之間，具有高活性粒子濃度的等離子體射流進(jìn)行誘變的新技術(shù)[3]。與傳統(tǒng)誘變方法相比，ARTP對(duì)遺傳物質(zhì)的損傷機(jī)制多樣，突變型多樣。ARTP 生物育種技術(shù)以其操作便捷性、安全性和高效性等特點(diǎn)得到了廣泛應(yīng)用，在微生物育種領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用[4]。ARTP已應(yīng)用于包括細(xì)菌、真菌、放線菌、酵母、微藻等在內(nèi)的40余種微生物的誘變育種[5]。

本文采用UV和ARTP對(duì)納豆芽孢桿菌進(jìn)行復(fù)合誘變（UV+ARTP），旨在篩選得到MK-7產(chǎn)量高的突變菌株，并對(duì)突變菌株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行研究，為該菌株應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ARTP-M 型常壓室溫等離子體誘變育種儀（無錫源清天木生物）； LC-20AT高效液相色譜系統(tǒng)（包括SPD-20A紫外檢測(cè)器，CTO-20A柱溫箱，7725i手動(dòng)進(jìn)樣器，LC-solution色譜工作站管理軟件，超聲波脫氣裝置等，日本島津）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義予華）；PHS-3C型酸度計(jì)（上海雷磁）；分析天平（北京賽多利斯）。

1.2 試劑

MK-7對(duì)照品（Sigma）；重蒸水；甲醇（色譜純，TEDIA），其他試劑均為分析純。

1.3 菌株

納豆芽孢桿菌（Bacillus natto），由實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.4 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂 15 g/L，pH 7.4～7.6，121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨 10 g/L，KH2PO45 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 60 g/L，高溫豆餅粉 30 g/L，蛋白胨 20 g/L，酵母浸粉 10 g/L，K2HPO4·3H2O 0.1 g/L，KH2PO40.5 g/L，NaCl 3 g/L，pH 7.0～7.2，115 ℃滅菌20 min。

2 方法

2.1 誘變方法

2.1.1 紫外誘變 取一只37 ℃培養(yǎng)18 h的新鮮斜面，用無菌生理鹽水洗下菌體，180 r/min振蕩60 min 使其充分打散，梯度稀釋至菌濃度107～108個(gè)/ml。取菌懸液5 ml，置于滅菌的直徑9 cm的平皿中，磁力攪拌作用下，在距18 W 紫外燈30 cm處進(jìn)行不同時(shí)間的照射處理，誘變時(shí)間分別設(shè)定為30，60，90，120，150，180，210，240 s。于紅光下分別進(jìn)行梯度稀釋，至菌濃度103～104個(gè)/ml，取0.1 ml 稀釋液涂布種子培養(yǎng)基平板，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h。通過平板菌落計(jì)數(shù)計(jì)算致死率，選擇合適的紫外誘變時(shí)間。致死率（%）=（對(duì)照高于各誘變時(shí)間的菌落數(shù)/對(duì)照菌落數(shù)）× 100 %。

2.1.2 ARTP 取一只37 ℃培養(yǎng)18 h的新鮮斜面，用無菌水洗下菌體，180 r/min振蕩15 min 使其充分打散，8000 r/min離心5 min收集菌體，以5 %甘油重懸，調(diào)整菌濃度107～108個(gè)/ml。開啟常溫常壓等離子系統(tǒng)，以酒精棉擦拭操作室內(nèi)外，并開啟紫外燈滅菌30 min。滅菌結(jié)束后取10 μl 菌懸液點(diǎn)于載片的粗糙面，并在無菌條件下將載片以鑷子轉(zhuǎn)移至操作室臺(tái)面上。開啟氦氣閥門，設(shè)定氣流量和誘變時(shí)間進(jìn)行誘變。誘變時(shí)間分別設(shè)定為10，20，30，40，50，60 s。每次誘變結(jié)束后均將載片置于含990 μl無菌生理鹽水的EP管中，漩渦震蕩1 min。稀釋涂布后置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h[6]。通過平板菌落計(jì)數(shù)計(jì)算致死率，選擇合適的ARTP處理時(shí)間。致死率（%） =（對(duì)照高于各誘變時(shí)間的菌落數(shù)/對(duì)照菌落數(shù)）× 100 %。

2.1.3 復(fù)合誘變 按2.1.1、2.1.2項(xiàng)方法，將菌懸液紫外誘變150 s后，8000 r/min離心3 min，收集菌體，用5 %甘油重懸菌體，開啟ARTP 系統(tǒng)對(duì)其誘變處理30 s[7]。誘變結(jié)束后將載片置于含990 μl 無菌生理鹽水的EP 管中，漩渦震蕩1 min后稀釋至10-3，10-4，10-53個(gè)稀釋度，涂布種子培養(yǎng)基固體平板，37 ℃培養(yǎng)48 h。從培養(yǎng)好的平板上挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定MK-7的產(chǎn)量。

2.2 培養(yǎng)方法

2.2.1 種子培養(yǎng) 于新鮮斜面上取1環(huán)菌體，接種于種子培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)18 h。

2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 按5 %的接種量將種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、80 r/min培養(yǎng)120 h。

2.3 分析方法

2.3.1 樣品處理 取10 ml發(fā)酵液，加入正己烷-異丙醇（2：1，v：v）30 ml萃取，于恒溫振蕩器上240 r/min強(qiáng)力震蕩15 min，靜置5 min，收集上清。將下層溶液重復(fù)萃取一次，合并2次上清，45 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，蒸干后加入5 ml乙腈洗蒸餾瓶，經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，待高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)[8-10]。

2.3.2 液相色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇；流速：1.5 ml/min；柱溫：50 ℃；紫外吸收波長(zhǎng)：270 nm。

3 結(jié)果與分析

3.1 MK-7的HPLC測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

用乙腈配置不同濃度的MK-7對(duì)照品溶液，按2.3.2項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以峰面積Y對(duì)濃度X（mg/L）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=8876.19X-28 403.3(R2=0.9987)，線性范圍：0.1～100 mg/L，MK-7的保留時(shí)間為38.7～38.9 min，與其他組分分離良好。對(duì)照品和供試品的HPLC圖譜見圖1、圖2。

圖1 MK-7對(duì)照品HPLC圖譜

圖2 發(fā)酵提取液HPLC圖譜

3.2 UV+ARTP復(fù)合誘變實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 紫外誘變 不同照射時(shí)間下的致死率結(jié)果見表1。隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株發(fā)生突變的可能性加大，與此同時(shí)菌株的致死率也在不斷上升，突變的優(yōu)良菌株也有可能因此致死，為得到有利于生產(chǎn)應(yīng)用的正突變型菌株，我們選擇致死率80 %～85 %的照射時(shí)間為紫外誘變的劑量，即采用18 W的紫外燈，垂直距離30 cm處，照射150 s。

表1 不同紫外線照射時(shí)間的致死率

3.2.2 ARTP處理 不同處理時(shí)間的致死率結(jié)果見表2。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株的致死率不斷升高，我們選擇致死率80 %～85 %的處理時(shí)間定為ARTP的誘變劑量，故誘變時(shí)間確定為30 s。

表2 不同ARTP 處理時(shí)間的致死率

3.2.3 UV+ARTP復(fù)合誘變 通過UV+ARTP復(fù)合誘變，從固體培養(yǎng)基平板上共挑選出77個(gè)單菌落，分別進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，驗(yàn)證突變株的MK-7產(chǎn)量。篩選得到了正突變株12株，正突變率為15.6 %。其中突變株UA31#產(chǎn)量最高，達(dá)20.5 mg/L，選擇UA31#作為后續(xù)研究對(duì)象。

表3 菌株UA31#遺傳穩(wěn)定性結(jié)果

3.3 菌株UA31#遺傳穩(wěn)定性

將突變菌株UA31#連續(xù)12次傳代培養(yǎng)，測(cè)定MK-7產(chǎn)量，以評(píng)價(jià)其遺傳穩(wěn)定性。以未經(jīng)傳代的誘變菌株的MK-7產(chǎn)量為基準(zhǔn)，計(jì)算變化率。結(jié)果見表3。由表3可見，菌株UA31#各代的MK-7產(chǎn)量基本維持在20 mg/L左右，變化率在±5 %范圍內(nèi)，表明其遺傳穩(wěn)定性較好。

4 討論

目前國(guó)內(nèi)對(duì)MK-7的研究多集中于菌種發(fā)酵優(yōu)化和產(chǎn)物提取檢測(cè)方面，微生物誘變育種的報(bào)道不多。檀沐等[11]利用亞硝基胍（NTG）和低能氮離子束（N+）注入復(fù)合誘變的方法處理產(chǎn)MK-7的黃色短桿菌，獲得的突變株產(chǎn)量為6.12 mg/L，較出發(fā)菌株提高了159 %。許靜[12]采用UV和NTG相結(jié)合的方法對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行誘變，獲得突變株產(chǎn)量為19.85 mg/L，較出發(fā)菌株提高了90.5 %。宋均營(yíng)等[13]利用NTG和N+注入復(fù)合誘變選育突變株，獲得的突變株MK-7的產(chǎn)量為2.32 mg/L左右，比原始菌株提高了166 %。

本文首次采用UV+ARTP復(fù)合誘變技術(shù)篩選高產(chǎn)MK-7的菌株，選育出的突變菌株UA31#搖瓶單位比出發(fā)菌株提高了162.8 %，達(dá)20.5 mg/L，經(jīng)連續(xù)傳代12次遺傳穩(wěn)定性良好。本研究結(jié)果表明，UV+ARTP復(fù)合誘變是一種獲得MK-7高產(chǎn)菌株的理想手段。當(dāng)然，誘變育種只是提高菌株生產(chǎn)MK-7的基礎(chǔ)產(chǎn)量，若要全面提高菌株的發(fā)酵水平，還要從培養(yǎng)基配方和發(fā)酵工藝的優(yōu)化等方面著手，并通過小試中試逐級(jí)放大，使之適用于工業(yè)化生產(chǎn)。