畢天琛，楊國(guó)寧，仝桂平，趙丹彤，劉延娟

（1.菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東 菏澤 274000；2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355）

薏苡仁為禾本科植物薏苡[Coix lacryma-jobiL.var.mayuen(Roman.) Stapf]的干燥成熟種仁[1]，收載于2015年版《中國(guó)藥典》（一部），是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用中藥，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[2]，被譽(yù)為“世界禾本科植物之王”[3]。

總量統(tǒng)計(jì)矩法是將指紋圖譜作為眾多高斯曲線疊加而成的概率密度曲線，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來分析指紋圖譜的內(nèi)在特征，按一維隨機(jī)向量統(tǒng)計(jì)原理，用總量零階矩（AUCT）、總量響應(yīng)率（AUCPWT）、總量一階矩（MCRTT）、總量二階矩（VCRTT）4個(gè)參數(shù)進(jìn)行全面的定性定量研究[4]。

目前，已有采用高效液相色譜（HPLC）和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）等方法建立薏苡仁指紋圖譜的相關(guān)研究報(bào)道[5-8]，但均未進(jìn)行系統(tǒng)的信息綜合處理分析。本文采用HPLC建立薏苡仁化學(xué)指紋圖譜后進(jìn)行總量統(tǒng)計(jì)矩分析，并采用夾角余弦法和相關(guān)系數(shù)法進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)合聚類分析和主成分分析對(duì)18批次薏苡仁飲片進(jìn)行指紋圖譜識(shí)別和分類，為薏苡仁質(zhì)量評(píng)價(jià)及標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1200高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；PL-ELS 2100蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（Polymer Laboratories公司）；XS105電子天平（梅特勒-托利多）；AB104-S電子天平（梅特勒-托利多）；FRQ-1010T超聲波清洗器（杭州法蘭特）； Milli-Q Advantage A10超純水儀（默克密理博公司）

1.2 試藥

甘油三油酸酯對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111692-201806，含量99.9 %）；乙腈（色譜純，德國(guó)默克公司）；二氯甲烷（色譜純，德國(guó)默克公司）。本實(shí)驗(yàn)收集18批次市售不同產(chǎn)地的薏苡仁飲片，并經(jīng)菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院馬海春研究員鑒定，詳見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-二氯甲烷（65：35）；柱溫30 ℃；流速1 ml/min；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器參數(shù)：漂移管溫度50 ℃；載氣體積流量為0.6 L/min。

表1 18批薏苡仁飲片來源

2.2 溶液的配制

2.2.1 供試品溶液的制備 稱取薏苡仁粉末（過三號(hào)篩）約0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入流動(dòng)相50 ml，稱定重量，浸泡2 h，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用流動(dòng)相補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取甘油三油酸酯對(duì)照品適量，置于量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋，制備成甘油三油酸酯濃度為0.14 mg/ml的對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一薏苡仁供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以甘油三油酸酯（6號(hào)峰）為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。結(jié)果各相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.56 %，各相對(duì)峰面積的RSD均小于2.05 %，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一薏苡仁供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0，2，4，6，8，12 h進(jìn)樣測(cè)定，以甘油三油酸酯（6號(hào)峰）為參照峰，計(jì)算測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。結(jié)果各相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.61 %，各相對(duì)峰面積的RSD均小于2.42 %，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一薏苡仁供試品6份，精密稱定，分別按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以甘油三油酸酯（6號(hào)峰）為參照峰，計(jì)算測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。結(jié)果各相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.88 %，各相對(duì)峰面積的RSD均小于2.61 %，表明方法的重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 指紋圖譜共有模式的建立 將18個(gè)不同批次薏苡仁樣品HPLC色譜圖分別導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012A）”軟件，選定S1號(hào)樣品色譜圖為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法自動(dòng)匹配生成對(duì)照?qǐng)D譜，結(jié)果見圖1。由圖1可知，共獲得7個(gè)共有峰，參照文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行定位[6-9]，指認(rèn)1～7號(hào)色譜峰依次為三亞油酸甘油酯、1, 2-亞油酸-3-油酸甘油酯、3-棕櫚酸二亞油酸甘油酯、1, 2-油酸-3-亞油酸甘油酯、棕櫚酸亞油酸油酸甘油酯、甘油三油酸酯、棕櫚酸二油酸甘油酯。其中6號(hào)峰（甘油三油酸酯）峰面積所占比例較大且相對(duì)穩(wěn)定，分離度較好，因此確定其為參照峰（S）。

圖1 18批薏苡仁樣品的疊加HPLC指紋圖譜（A）與對(duì)照指紋圖譜（B）

2.4.2 共有峰相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積 以各批次的6號(hào)峰為參照峰（甘油三油酸酯），計(jì)算同一樣品圖譜中各共有峰的相對(duì)峰面積，結(jié)果見表2。由表2可見，相對(duì)峰面積波動(dòng)較大，RSD范圍為0～27.126 %，表明薏苡仁指紋圖譜中主要峰群的整體面貌基本一致，但各成分含量差別較大。

表2 各共有峰的相對(duì)峰面積

2.4.3 總量統(tǒng)計(jì)矩分析 采用總量統(tǒng)計(jì)矩分析法計(jì)算總量零階矩（AUCT）、總量響應(yīng)率（AUCPWT）、總量一階矩（MCRTT）、總量二階矩（VCRTT）[10]等總量統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)，根據(jù)計(jì)算結(jié)果評(píng)價(jià)不同批次薏苡仁樣品的差異，結(jié)果見表3。

表3 18批次薏苡仁樣品的總量統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)

由表3可見，不同產(chǎn)地薏苡仁樣品的指紋圖譜的總量統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)差異明顯，表明不同產(chǎn)地薏苡仁在“量”上具有一定的差異性，就總量響應(yīng)率（AUCPWT）而言，S17最大，S4最小。

2.4.4 相似度評(píng)價(jià) 分別采用夾角余弦法和相關(guān)系數(shù)法[11]對(duì)18批薏苡仁樣品的HPLC指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，結(jié)果見表4。夾角余弦法計(jì)算的相似度均在0.97以上，相關(guān)系數(shù)法計(jì)算的相似度均在0.98以上。兩種相似度評(píng)價(jià)結(jié)果均表明各批次薏苡仁樣品的質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定，具有較高的相似度。

2.5 聚類分析

采用SPSS 22.0軟件，以18批次薏苡仁飲片的7個(gè)共有峰峰面積數(shù)據(jù)為變量，選用組間聯(lián)接法，Euclidean距離為測(cè)度，進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖2。18批次樣品可聚為3類，其中S17 為單獨(dú)一類，S1、S6、S9、S12、S16、S18聚為一類，其余樣品聚為一類。觀察各批次樣品共有峰相對(duì)峰面積可發(fā)現(xiàn)，S17中7個(gè)色譜峰面積均高于其余樣品，含量均為最高，說明其整體質(zhì)量相對(duì)較好。

表4 夾角余弦法和相關(guān)系數(shù)法計(jì)算不同產(chǎn)地薏苡仁樣品的相似度

圖2 18批次薏苡仁樣品聚類分析樹狀圖

2.6 主成分分析

將指紋圖譜中7個(gè)共有峰的峰面積數(shù)據(jù)為變量，構(gòu)建18×7的原始數(shù)據(jù)矩陣，采用SPSS22.0 軟件，對(duì)18批次薏苡仁樣本進(jìn)行主成分分析。主成分個(gè)數(shù)提取原則為主成分的特征值大于1的前m個(gè)主成分，結(jié)果見表5、表6。

表5 薏苡仁主成分分析的特征值與方差貢獻(xiàn)率結(jié)果

表6 薏苡仁主成分載荷矩陣

由表5可知，提取到了1個(gè)主成分，特征值為5.900，方差貢獻(xiàn)率為84.283%。由表6可見，2～7號(hào)峰在第一種主成分上載荷均大于0.91，說明2～7號(hào)峰成分對(duì)薏苡仁的質(zhì)量貢獻(xiàn)較大，其含量的高低影響薏苡仁藥材質(zhì)量的優(yōu)劣。

以上述1個(gè)主成分因子為變量繪制得分圖，見圖3。18批次樣品可歸為3組，S17樣品為一組，S9、S12、S16、S1、S18和S6為一組，其余樣品為一組。與聚類分析結(jié)果相近；但在S6的分組上，兩種分析結(jié)果略有差異。

圖3 不同批次薏苡仁樣品主成分得分散點(diǎn)圖

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

本研究在供試品溶液的制備過程中，分別考察了甲醇-二氯甲烷（60：40）、含10 %，20 %，35 %，50 %二氯甲烷的乙腈溶液5種提取溶劑及超聲、回流兩種提取方法的提取效果，結(jié)果以乙腈-二氯甲烷（65：35）為提取液，先靜置2 h，再超聲處理30 min鐘提取的供試品溶液色譜圖效果最好，且處理方法簡(jiǎn)便?？疾炝瞬煌鶞?、漂移管溫度和載氣體積流量下峰形的變化，發(fā)現(xiàn)柱溫為30 ℃，漂移管溫度為50 ℃，載氣體積流量為0.6 L/min時(shí)，色譜峰保留時(shí)間、峰形和分離度較理想。

3.2 薏苡仁飲片指紋圖譜識(shí)別

本研究采用HPLC-ELSD建立了18批次薏苡仁飲片的指紋圖譜，共標(biāo)定7個(gè)共有峰，并通過文獻(xiàn)比對(duì)指認(rèn)7個(gè)共有峰分別為三亞油酸甘油酯、1, 2-亞油酸-3-油酸甘油酯、3-棕櫚酸二亞油酸甘油酯、1, 2-油酸-3-亞油酸甘油酯、棕櫚酸亞油酸油酸甘油酯、甘油三油酸酯、棕櫚酸二油酸甘油酯。

在指紋圖譜識(shí)別模式中采用總量統(tǒng)計(jì)矩分析法計(jì)算出各批次樣品的總量統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)，結(jié)果顯示，各批次樣品的總量統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)差異較大，其中S17 值偏大，S1、S6、S9、S12、S16、S18值較相近，其余樣品值較相近，其結(jié)果與聚類分析和主成分分析結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本研究采用相似度評(píng)價(jià)、聚類分析與主成分分析法對(duì)各批次樣品進(jìn)行分類識(shí)別分析，結(jié)果表明各批次樣品在定性分析中具有較高的相似性，但不同批次樣品在7種成分含量上有較大差異。主成分分析發(fā)現(xiàn)2～7號(hào)色譜峰對(duì)薏苡仁的質(zhì)量貢獻(xiàn)均大于0.9，說明這些成分的含量高低對(duì)薏苡仁質(zhì)量影響較大，提示薏苡仁飲片質(zhì)量控制局限于甘油三油酸酯單一檢測(cè)，不能全面有效地反應(yīng)樣品整體質(zhì)量狀況，應(yīng)進(jìn)一步研究其余5種成分對(duì)其質(zhì)量的影響。綜上所述，本研究建立的薏苡仁飲片HPLC指紋圖譜，結(jié)合總量統(tǒng)計(jì)矩分析、相似度分析、聚類分析和主成分分析法，可較系統(tǒng)全面地反映薏苡仁飲片的整體質(zhì)量狀況。