徐巾超，陳勇，2，葉輝青，張杰，張霽，2，羅忠華，2

（1 廣東東陽光藥業(yè)有限公司，廣東東莞523871； 2 抗感染新藥研發(fā)國家重點實驗室，廣東東莞523871）

引 言

難溶性是制約候選藥物成為臨床藥物的關(guān)鍵因素之一[1]，近年來進入市場有不少新藥，但變得愈來愈普遍的是，研發(fā)中的候選藥物水溶性不好[2]。據(jù)估計，大約有40%的口服速釋藥物被歸類為幾乎不溶[3]。通過組合篩選程序鑒定的70%或更多的新化學(xué)實體(new chemical entity，NCE)水溶性也很差[4]。改善藥物的溶解性，從而提升生物利用度是難溶性藥物成藥的重要手段。在藥物產(chǎn)品的研發(fā)過程中，藥物中活性成分的物理化學(xué)性質(zhì)必須優(yōu)化，如溶解性、生物利用度和穩(wěn)定性等[5-8]。藥物共晶能夠改善藥物的一些重要物理化學(xué)性質(zhì)，也有利于藥物合成和生產(chǎn)工藝的綠色化。文獻報道的可用于研發(fā)改善藥物物理化學(xué)性質(zhì)的潛在方法手段有形成共晶、多晶型、溶劑化物、水合物和鹽[9-12]。美國藥物管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)在2016 年發(fā)布的《藥物共晶監(jiān)管分類指南》[13]中明確給出了共晶的定義“共晶是兩種或多種不同分子以同樣晶格構(gòu)成的結(jié)晶物質(zhì)，通常是藥物和共晶配體。它們不同于鹽而更像溶劑化物，雖然都是一個晶格中含有多于一個的組分”。從物理化學(xué)性質(zhì)角度看，共晶可看作是溶劑化物和水合物的特殊情形，其中第二組分共晶配體是非易失形的。

近年來，藥物共晶[14-18]作為一種新興的藥物晶型，通過引入共晶配體(co-crystal coformers,CCF)可改變其活性藥物成分(active pharmaceutical ingredient,API)的諸多理化性質(zhì)[19-23]。2015 年，諾華的EntrestoTM(代號LCZ696)獲得了FDA 的批準(zhǔn)，用于治療慢性心衰竭[24]，是有限的幾個被FDA 批準(zhǔn)的藥物共晶之一。EntrestoTM由沙庫巴曲單鈉鹽、纈沙坦二鈉鹽和水組成[25]，臨床數(shù)據(jù)證明，不僅顯著降低死亡率且在患者耐受性上與依那普利相似。另一個共晶藥物是埃格列凈-L-焦谷氨酸共晶(ertugliflozin)[26]，于2017 年12 月由FDA 批準(zhǔn)用于治療糖尿病的新型藥物。這些共晶藥物的獲批上市進一步提升了研究者和制藥公司對共晶開發(fā)的關(guān)注，通過共晶研究來改善藥物的理化性質(zhì)或者生物利用度以達到提早應(yīng)用的目的。

羅沙司他(愛瑞卓Roxadustat，RDXT)，由琺博進(FibroGen)、阿斯利康(AstraZeneca)和安斯泰來(Astellas)聯(lián)合開發(fā)，是全球首個開發(fā)的小分子低氧誘導(dǎo)因子脯氨酰羥化酶抑制劑類治療腎性貧血(chronic kidney disease，CKD)的藥物。2017年12月，羅沙司他膠囊被中國藥審中心納入優(yōu)先審評公示名單，并于2018 年12 月17 日獲批上市。該藥是首個在中國本土孵化、首個率先在中國獲批的全球首創(chuàng)原研藥，用于透析依賴的慢性腎衰性貧血。目前全世界范圍慢性腎病的發(fā)生率達8%～16%，在中國慢性腎病發(fā)生率達10.8%，大約有1.2 億人，CKD 已成為一個重要的全球醫(yī)療保健問題，代表著一個龐大且日益增長的未滿足的醫(yī)療需求。最近，RDXT在治療非透析慢性腎臟病患者貧血的Ⅲ期臨床研究也達到了主要終點[27-28]。

然而，RDXT 的水溶性較差，在水中的溶解度僅為1.71 mg/L[29]。據(jù)專利報道[30],RDXT原研晶型與鹽型專利中包含了游離酸的晶型A、B、C、D，以及鈉鹽、鉀鹽、賴氨酸鹽等，其中原研上市的晶型為A。目前未見有RDXT 共晶的報道，對RDXT 開展多晶型篩選有重要意義。設(shè)計了數(shù)百組實驗,最終只得到若干溶劑合物，沒有得到令人滿意的游離酸晶型，于是開展了共晶研究。本研究選用RDXT 為模型藥物，對一系列CCF 進行500多組實驗的篩選，先后制備出RDXT與煙酰胺、肉桂酰胺、苯甲酰胺和脯氨酸四種共晶并進行表征，對其溶出速率、溶解性和穩(wěn)定性進行研究。根據(jù)FDA 的指南，設(shè)計新共晶的藥物被認為是類似于API 的新固體形態(tài)，有別于成鹽的方式。

圖1 羅沙司他以及CCF的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of roxadustat(RDXT)and CCF

1 實驗材料和方法

1.1 材料

RDXT 購自上海再啟生物技術(shù)有限公司，純度≥98%，通過XRD 對原料進行表征，可知原料晶型為晶型A[29]。煙酰胺和苯甲酰胺(aladdin)純度≥99%，肉桂酰胺(energy chemical)純度≥97%，脯氨酸(accela)純度≥98%，所有試劑(西隴化學(xué))均為分析純，實驗用水為去離子水。

1.2 方法

1.2.1 羅沙司他共晶的制備 羅沙司他-煙酰胺共晶(RDXT-N)的制備實驗：采用溶液冷卻結(jié)晶法，40～60℃下將煙酰胺和RDXT溶于丙酮中，CCF和API的投料摩爾比為2∶1，溶清后緩慢降溫至0℃，析出固體，養(yǎng)晶后過濾、真空干燥得到羅沙司他-煙酰胺共晶。羅沙司他-肉桂酰胺共晶(RDXT-C)的制備實驗：采用溶液混懸結(jié)晶法，室溫條件下將肉桂酰胺溶于丙酮中，加入RDXT，CCF 和API 的投料摩爾比為2∶1，溶液混懸攪拌2～12 h 過濾、真空干燥得到羅沙司他-肉桂酰胺共晶。羅沙司他-苯甲酰胺共晶(RDXT-B)的制備實驗：采用反溶劑溶析結(jié)晶法，室溫條件下將等物質(zhì)的量的苯甲酰胺和RDXT溶于良溶劑1,4-二氧六環(huán)中，攪拌溶清后，滴加反溶劑正庚烷，有大量固體析出，攪拌2～12 h 過濾、干燥得到羅沙司他-苯甲酰胺共晶。羅沙司他-脯氨酸共晶(RDXT-P)的制備實驗：采用反溶劑溶析結(jié)晶法，室溫條件下將等物質(zhì)的量的脯氨酸和RDXT溶于甲醇和乙二醇二甲醚的混合溶劑中，溶清后滴加反溶劑正庚烷，有大量固體析出，攪拌2～12 h 后過濾、干燥，得到羅沙司他-脯氨酸共晶。

1.2.2 羅沙司他共晶的表征 四種RDXT 共晶的X射線粉末衍射法(XRD)(Empyrean，PANalytical，荷蘭)測試條件為：Cu Kα為光源，電壓45 kV，電流40 mA，掃描范圍3°～40°，掃描步長0.0168°。差式掃描量熱法(DSC)(Q2000，TA Instruments，美國)的測試方法為：在氮氣保護下將2～5 mg 樣品置于鋁坩堝中，測試溫度范圍為室溫～300℃，升溫速率為10℃/min。熱重分析法(TGA)(Q500，TA Instruments，美國)的測試方法為：在氮氣保護下將5～10 mg 樣品置于鋁坩堝中，測試溫度范圍為室溫～300℃，升溫速率為10℃/min。傅里葉紅外光譜分析[31](FTIR)(TENSORⅡ，Bruker，德國)采用KBr 壓片，掃描范圍為4000～400 cm-1。核磁共振氫譜分析法(1H NMR)(AdvanceⅢHD 600，Bruker，瑞士)中樣品用氘代DMSO 溶解后進行1H NMR測試。

1.2.3 固有溶出速率測試 API 的固有(特性)溶出速率可以預(yù)測潛在的生物利用度問題，本研究參照USP 附錄＜1087＞固有溶出速率的測定方法，分別檢測了RDXT 四種共晶和API 在pH 4.5 和pH 6.8 緩沖液中的固有溶出速率并進行對比。實驗方法：稱取適量粉末置于溶出模具中，用壓片機(digital hydraulic press 數(shù)顯手動液壓壓片機，PIKE，美國)按壓力55 kN 壓片、保持30 s，將壓制好的片與模具置于溶出杯中，采用槳法，溶出介質(zhì)900 ml，轉(zhuǎn)速50 r/min，溫度(37 ± 0.2)℃，使用在線光纖紫外檢測系統(tǒng)(Rainbow，PION，美國)在線實時監(jiān)測濃度變化[32]，全波長200～720 nm 掃描，采樣間隔由最初的密集取樣20 s、30 s、1 min(0～40 min)逐漸變?yōu)? min(40～100 min)、10 min(100～700 min)、20 min(11～41 h)，計算溶出度并繪制溶出曲線。測試完成后，將剩余的樣品過濾，干燥。

1.2.4 平衡溶解度測試 本研究借助水浴恒溫振蕩器(SHZ-B，常州國立)充分溶解RDXT 及其共晶：在離心管中稱取過量的樣品，加入4.5 ml 水并置于37℃下的恒溫振蕩器中振搖24 h后取樣檢測。采用紫外可見分光光度計(Cary 60，Agilent，美國)檢測濃度，測定純水中的平衡溶解度。方法如下：首先掃描得到RDXT 的特征吸收波長為387 nm，在該波長下四種CCF 都無紫外吸收峰。接著在387 nm 波長下利用濃度和吸收強度的關(guān)系繪制RDXT溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)度為99.99%。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和吸光度來計算RDXT和共晶在水中的溶解度。每個樣品平行測量2 次取平均值。測試完成后，將剩余的樣品過濾，干燥。

1.2.5 影響因素穩(wěn)定性測試 分別取RDXT 和四種共晶的樣品適量，平鋪于潔凈培養(yǎng)皿中，攤成厚度≤5 mm 的薄層，分別在高溫(60±2)℃、高濕((90%±5%)RH)、光照(可見光（4500±500）cm-1，紫外線不低于0.7（W·h）/m2，（25 ± 2）℃，（60% ± 5%）RH)條件下進行影響因素穩(wěn)定性實驗，敞口放置15 d，用XRD檢測樣品的晶型。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 共晶表征與分析

RDXT晶型A和四種共晶產(chǎn)品的XRD表征如圖2 所示，譜圖中新特征峰的出現(xiàn)可以確認新晶型的形成。圖2(a)中RDXT-C 共晶在6.22°±0.2°、10.46°±0.2°、14.57°±0.2°、25.30°±0.2°等處出現(xiàn)新的特征峰，而晶型A 中位于8.41°±0.2°、11.39°±0.2°、16.25°±0.2°、21.56°±0.2°、22.90°±0.2°等的特征峰消失；在圖2(b)中 晶 型A 中 位 于11.39°±0.2°、12.83°±0.2°、22.90°±0.2°、25.80°±0.2°等處的特征峰消失，在RDXT-N 共 晶 中 出 現(xiàn) 了6.30°±0.2°、10.90°±0.2°、14.31°±0.2°、20.54°±0.2°等處的新峰；在圖2(c)圖中晶型A 中位于8.41°±0.2°、11.39°±0.2°、18.90°±0.2°、25.80°±0.2°等處的特征峰消失，在RDXT-B 共晶中出現(xiàn)了6.71°±0.2°、10.64°±0.2°、11.11°±0.2°、18.14°±0.2°、25.32°±0.2°等處的新峰；最后在圖2(d)中晶型A 中 位 于8.41°±0.2°、12.83°±0.2°、16.25°±0.2°、22.59°±0.2°、24.66°±0.2°等處的特征峰消失，在RDXT-P 共 晶 中 出 現(xiàn) 了3.63°±0.2°、7.15°±0.2°、10.75°±0.2°、14.31°±0.2°、20.39°±0.2°等處的新峰。

DSC 曲線如圖3所示，RDXT 晶型A 的熔融峰峰值溫度為223.4℃，四種共晶都只有單一的熔融峰，均低于晶型A的熔點。其中RDXT-C共晶的熔融峰值溫度為167.7℃，RDXT-N 共晶為156.2℃，RDXTB共晶為172.7℃，RDXT-P共晶為188.4℃。

圖2 羅沙司他四種共晶的XRD譜圖Fig.2 XRD patterns of RDXT co-crystals

圖3 羅沙司他四種共晶的DSC譜圖Fig.3 DSC curves of RDXT co-crystals

圖4 是共晶的IR 譜圖，由圖4(a)可以看出，RDXT 位于1728 cm-1羧酸中的C====O 伸縮振動峰在RDXT-C共晶中向較低波數(shù)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移至1718 cm-1，肉桂酰胺歸屬3374 cm-1的N—H 伸縮振動峰，在RDXT-C共晶中向高波數(shù)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移到了3400 cm-1，由此推測RDXT 分子是通過氫鍵C====O…H—N 與肉桂酰胺形成共晶；這種遷移在RDXT-B 共晶[圖4(c)]中同樣存在，即預(yù)測RDXT 分子亦是通過氫鍵C====O…H—N 與苯甲酰胺形成共晶。在圖4(b)中可以看到，RDXT位于1728 cm-1的C====O伸縮振動峰在RDXT-N 共晶中位移不變，而位于1639 cm-1的C====O 振動在共晶中遷移至1590 cm-1，推測出煙酰胺分子中的氨基與RDXT酰胺基團中的羰基形成氫鍵N—H…O====C，而非羧酸中的羰基形成氫鍵。圖4(d)圖中RDXT 位于1728 cm-1的羧基中的C====O 振動峰在RDXT-P 共晶中偏移至低波1712 cm-1處，并且脯氨酸位于3381 cm-1的N—H 伸縮振動峰在RDXT-P 共晶中并無偏移，因此推測出脯氨酸分子中的羥基通過氫鍵O—H…O====C 與RDXT 形成共晶。

核磁共振氫譜如圖5 所示，四個共晶的譜圖顯示均沒有發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移，證明了形成的是共晶而非成鹽；通過核磁共振氫譜分析，計算出四個共晶分子中API和CCF的摩爾比均是1∶1。

2.2 固有溶出速率研究

RDXT 及其四種共晶在pH 4.5 和pH 6.8 的緩沖液中的固有溶出速率分別如圖6 和圖7 所示。從圖6 中可以看出，在pH 4.5 緩沖液中，四種共晶的固有溶出速率都比RDXT 晶型A 的大，其中RDXT-C 的溶出速率最大，達到溶出平臺后的溶解度將近RDXT 晶型A 的10 倍，其次溶出較快的是RDXT-N和RDXT-B 共晶。從圖7 中曲線斜率可以明顯看出，在pH 6.8 緩沖液中溶出速率的大小順序為：RDXT-C 共 晶＞RDXT-B 共 晶＞RDXT 晶 型A＞RDXT-P共晶＞RDXT-N共晶。

2.3 平衡溶解度研究

在純水中37℃條件下溶解度數(shù)據(jù)如圖8 所示，溶解度相對大小為：脯氨酸共晶＞肉桂酰胺共晶＞煙酰胺共晶＞苯甲酰胺共晶＞RDXT 晶型A。其中脯氨酸共晶的溶解度最大，為RDXT 晶型A 溶解度的5.3倍；肉桂酰胺共晶的溶解度為RDXT 晶型A 溶解度的5.2 倍；煙酰胺共晶的溶解度是RDXT 晶型A 的4倍；苯甲酰胺共晶的溶解度是RDXT 晶型A 的3.7倍。

圖4 羅沙司他四種共晶的IR譜圖Fig.4 Infrared spectra(IR)of RDXT co-crystals

圖5 羅沙司他四種共晶的1H NMR譜圖Fig.5 1H NMR spectrum of RDXT co-crystals

圖6 羅沙司他四種共晶和晶型A在pH 4.5緩沖液中的固有溶出曲線Fig.6 Intrinsic dissolution rate of RDXT co-crystals and form A in pH 4.5 buffer

圖7 羅沙司他四種共晶和晶型A在pH 6.8緩沖液中的固有溶出曲線Fig.7 Intrinsic dissolution rate of RDXT co-crystals and form A in pH 6.8 buffer

雖然脯氨酸共晶、煙酰胺共晶和苯甲酰胺共晶在達到平衡時都已轉(zhuǎn)化為晶型A，但它們?nèi)跃哂刑岣呷芙舛鹊男Ч?，其中脯氨酸共晶在這四個共晶中的溶解度最大，這是由于脯氨酸這種CCF 有較好的水溶解性，使得共晶更易與水親和溶解。在溶液中，固態(tài)形式的轉(zhuǎn)變是介穩(wěn)晶型的溶解和穩(wěn)定晶型析出的平衡過程，最初的溶解的共晶在達到平衡時不一定全部析出轉(zhuǎn)變?yōu)榫虯，所以各個共晶的平衡溶解度也不一定和晶型A 保持一致，本研究的四種共晶都達到了提升溶解度的效果[33]。

2.4 影響因素穩(wěn)定性研究

在高溫(60 ± 2)℃、高濕((90% ± 5%) RH)、光照(可見光（4500 ± 500）cm-1，紫外線不低于0.7 (W·h)/m2，(25 ± 2)℃，（60% ± 5%) RH)條件下放置15 d，其中羅沙司他-肉桂酰胺共晶和煙酰胺共晶的XRD 譜圖與0 d 數(shù)據(jù)無差異，晶型未發(fā)生改變。苯甲酰胺共晶在高溫條件下5 d后出現(xiàn)晶型A的特征峰，其余條件下晶型均未變化；脯氨酸共晶在高濕條件下轉(zhuǎn)成晶型A，在高溫和光照條件下穩(wěn)定。

圖8 羅沙司他四種共晶和晶型A在純水中的平衡溶解度(37℃)Fig.8 Solubility of RDXT co-crystals and form A in water at 37℃

3 結(jié) 論

(1)通過溶液結(jié)晶法制備了羅沙司他-肉桂酰胺、羅沙司他-煙酰胺、羅沙司他-苯甲酰胺和羅沙司他-脯氨酸四種共晶，并通過XRD、DSC、TGA、FTIR和1H NMR的表征確認了共晶的形成。

(2)固有溶出實驗證明：在pH 4.5 緩沖液中，四種共晶的固有溶出速率均比晶型A 的溶出速率快，羅沙司他-肉桂酰胺共晶的溶出速率將近晶型A 的10 倍；在pH 6.8 緩沖液中，羅沙司他-肉桂酰胺和羅沙司他-煙酰胺共晶的溶出速率高于晶型A。在純水中37℃條件下，脯氨酸共晶的溶解度最大，為晶型A 溶解度的5.3 倍，顯著提高了羅沙司他的溶解度。

(3)結(jié)合影響因素穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，煙酰胺共晶和肉桂酰胺共晶有著良好的穩(wěn)定性，在高濕、光照、高溫條件下晶型均保持不變。

(4)上述研究結(jié)果表明，羅沙司他-肉桂酰胺、羅沙司他-煙酰胺、羅沙司他-苯甲酰胺和羅沙司他-脯氨酸四種共晶能有效地提高溶解度和溶出速率，并且有著良好的穩(wěn)定性。因此制備出的羅沙司他四個共晶對于新劑型、新藥的開發(fā)具有重要意義。