夏永嚴(yán)

骨質(zhì)疏松癥是臨床上常見的骨科疾病之一，以骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)的破壞為主要特征，具有較高的全身性骨折風(fēng)險(xiǎn)，且隨著社會(huì)老齡化和人們生活飲食的改變，其發(fā)病率逐年增加，嚴(yán)重影響患者的身體健康[1,2]。有研究報(bào)道，血管新生在骨形成過程中具有重要的作用，可為成骨細(xì)胞形成新骨提供充足的血供，其中堿性成纖維細(xì)胞因子(bFGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)是刺激血管新生的重要因子[3,4]。而紅景天苷是一種由紅景天提純制成的中藥成分，具有活血化瘀、通脈止痛之功效，有助于改善血液循環(huán)及促進(jìn)血管新生[5]，但關(guān)于其對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的作用筆者能找到的報(bào)道較少。對(duì)此，本研究通過給予MG-63人成骨細(xì)胞進(jìn)行紅景天苷培養(yǎng)，并檢測(cè)其bFGF、VEGF表達(dá)情況，以深入了解紅景天苷抵抗成骨細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，為臨床防治骨質(zhì)疏松癥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 MG-63人成骨細(xì)胞(美國(guó) ATCC公司生產(chǎn)，武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提供)，紅景天苷(A0076)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，DMEM培養(yǎng)基(中國(guó)上海GIBICO公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)(北京Solarbio公司)，二甲基亞砜(DMSO)和四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(美國(guó)Sigma公司)，新生胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，鼠抗人bFGF、VEGF抗體(上海聯(lián)世生物科技有限公司)，茜素紅、硝酸銀染色顯色試劑盒(美國(guó)Pierce公司)，成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒(賽業(yè)生物科技有限公司)，其余試劑均購(gòu)自(上海貝博有限公司)；680型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，顯微鏡和共聚焦熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，核酸蛋白測(cè)定儀和化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(美國(guó)GE公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)，其余設(shè)備均購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 成骨細(xì)胞的培養(yǎng)：將復(fù)蘇后的MG-63人成骨細(xì)胞置入質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d、隔天換液，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好和密度>85%時(shí)的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)后，換含10 g/L的FBS、DMEM放入孵育箱培養(yǎng)1 d以使細(xì)胞同步化。

1.2.2 成骨細(xì)胞的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MG-63人成骨細(xì)胞接種于96孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/孔、PBS為200 μl/孔、設(shè)6個(gè)復(fù)孔，在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分為紅景組和對(duì)照組，每組48孔，對(duì)照組給予常規(guī)培養(yǎng)3 d，紅景組在對(duì)照組基礎(chǔ)上給予100 nmol/L紅景天苷培養(yǎng)3 d，并于培養(yǎng)當(dāng)日和培養(yǎng)1、3 d后每孔加10 μl濃度為5 g/L的MTT孵育4 h，每孔加100 μl的DMSO，震蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)492 nm波長(zhǎng)吸光度(MTT值)，測(cè)3次并取平均值。

1.2.3 bFGF、VEGF的Western blot(WB)法檢測(cè)：于培養(yǎng)當(dāng)日和培養(yǎng)1、3 d提取細(xì)胞總蛋白、檢測(cè)蛋白濃度后，定量、加上樣緩沖液99℃變性10 min，蛋白上樣后，電泳、轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，50 g/L的脫脂牛奶封閉 2 h 后，設(shè)β-actin對(duì)照組，分別加1∶1 000的bFGF和1∶20 000的GAPDH一抗，4℃過夜雜交后，洗膜、加入二抗室溫雜交1 h，洗膜后加入顯影液顯影，測(cè)3次并取平均值，以相同方法檢測(cè)VEGF表達(dá)水平。

1.2.4 成骨細(xì)胞的骨化結(jié)節(jié)染色實(shí)驗(yàn)：于培養(yǎng)當(dāng)日和培養(yǎng)1、3 d取MG-63人成骨細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化并培養(yǎng)至第三代后，以細(xì)胞數(shù)2.5×105個(gè)/孔接種于96孔板中，待細(xì)胞鋪至孔底>70%時(shí)加入100 μl的30 μmol/L成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液培養(yǎng)3 d，吸去培養(yǎng)液、PBS清洗2次、4%多聚甲醛固定30 min后，行茜素紅和硝酸銀染色，并觀察骨化結(jié)節(jié)情況。

2 結(jié)果

2.1 2組bFGF、VEGF的WB值比較 2組培養(yǎng)當(dāng)日bFGF、VEGF的WB值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；紅景組培養(yǎng)1、3 d bFGF、VEGF的WB值明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、2,圖1、2。

組別培養(yǎng)當(dāng)日培養(yǎng)1 d培養(yǎng)3 d對(duì)照組0.42±0.050.46±0.070.48±0.07紅景組0.43±0.060.57±0.100.64±0.11t值0.8876.2438.502P值0.377<0.001<0.001

組別培養(yǎng)當(dāng)日培養(yǎng)1 d培養(yǎng)3 d對(duì)照組0.51±0.070.53±0.090.54±0.09紅景組0.50±0.070.62±0.100.71±0.11t值0.7004.6358.287P值0.486<0.001<0.001

AB

圖1對(duì)照組bFGF的WB：A為bFGF，從左至右分別為培養(yǎng)當(dāng)日和培養(yǎng)1、3 d；B為VEGF，從左至右分別為培養(yǎng)當(dāng)日和培養(yǎng)1、3 d

AB

圖2紅景組VEGF的WB：A為bFGF，從左至右分別為培養(yǎng)當(dāng)日和培養(yǎng)1、3 d；B為VEGF，從左至右分別為培養(yǎng)當(dāng)日和培養(yǎng)1、3 d

2.2 2組MTT值(A492)比較 2組培養(yǎng)當(dāng)日MTT值(A492)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；紅景組培養(yǎng)1、3 d后MTT值(A492)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3,圖3、4。

組別培養(yǎng)當(dāng)日培養(yǎng)1 d培養(yǎng)3 d對(duì)照組0.661±0.0720.705±0.0830.817±0.087紅景組0.654±0.0740.961±0.0981.302±0.134t值0.47013.81121.032P值0.639<0.001<0.001

ABC

圖3對(duì)照組MTT觀察(顯微鏡×100)；A為培養(yǎng)當(dāng)日，B為培養(yǎng)1 d，C為培養(yǎng)3 d

2.3 2組骨化結(jié)節(jié)數(shù)比較 2組培養(yǎng)當(dāng)日骨化結(jié)節(jié)數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；紅景組組培養(yǎng)1、3 d骨化結(jié)節(jié)數(shù)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4,圖5、6。

ABC

圖4紅景組MTT觀察(顯微鏡×100)；A為培養(yǎng)當(dāng)日，B為培養(yǎng)1 d，C為培養(yǎng)3 d

表4 2組骨化結(jié)節(jié)數(shù)比較 n=48,個(gè)/孔,

ABC

圖5對(duì)照組成骨細(xì)胞的骨化結(jié)節(jié)染色實(shí)驗(yàn)(茜素紅和硝酸銀染色大體觀察)：A為培養(yǎng)當(dāng)日，B為培養(yǎng)1 d，C為培養(yǎng)3 d

ABC

圖6紅景組成骨細(xì)胞的骨化結(jié)節(jié)染色實(shí)驗(yàn)(茜素紅和硝酸銀染色大體觀察)：A為培養(yǎng)當(dāng)日，B為培養(yǎng)1 d，C為培養(yǎng)3 d

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種由多原因引起骨密度和骨質(zhì)量下降的骨病，可導(dǎo)致骨微結(jié)構(gòu)損害和骨脆性增加，主要表現(xiàn)有腰背痛、駝背、脆性骨折等癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1,2]。而大量研究證實(shí)，骨骼的正常生長(zhǎng)是由成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的細(xì)胞功能共同維持的骨代謝動(dòng)態(tài)平衡所決定，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥時(shí)，會(huì)使成骨細(xì)胞凋亡增加、破骨細(xì)胞凋亡減少，導(dǎo)致骨形成平衡破壞而使骨化減弱，導(dǎo)致骨微結(jié)構(gòu)損害和骨密度、骨質(zhì)量下降，最終導(dǎo)致骨折的發(fā)生[6,7]。

有研究顯示，血供不足所致缺血缺氧在骨質(zhì)疏松癥骨形成減少中具有重要的作用，尤其是毛細(xì)血管數(shù)量及血流減少，可使成骨細(xì)胞處于低血供低氧狀態(tài)而加快其凋亡，從而引起骨代謝的變化，導(dǎo)致骨生成減少、骨量丟失[8,9]。而紅景天苷是一種具有活血化瘀、通脈止痛功效的中藥成分，具有抗缺氧、促血管新生、改善血供等多種藥理作用[10,11]。近年來，相關(guān)研究報(bào)道，紅景天苷被逐漸應(yīng)用于多種骨病的治療中，有助于促進(jìn)骨形成而受到關(guān)注和重視，但關(guān)于其對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制尚未明確[5]。

此外，bFGF是一種能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)，對(duì)成纖維細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等具有強(qiáng)效的促細(xì)胞分裂增殖活性作用，可參與血管形成、組織修復(fù)再生和神經(jīng)組織生長(zhǎng)發(fā)育等[12,13]。而VEGF是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)及誘導(dǎo)血管新生，在血管形成中具有強(qiáng)效的促進(jìn)作用[14]。

本研究結(jié)果顯示，紅景組培養(yǎng)1、3 d bFGF、VEGF的WB值明顯高于對(duì)照組，紅景組培養(yǎng)1、3 d MTT值(A492)明顯高于對(duì)照組，表明紅景天苷可能通過上調(diào)bFGF、VEGF表達(dá)來抵抗MG-63人成骨細(xì)胞的凋亡。這可能是由于bFGF、VEGF與骨的形成與修復(fù)密切相關(guān)，其表達(dá)水平直接影響到成骨細(xì)胞的血供、形成速度與骨化質(zhì)量。而在本研究給予MG-63人成骨細(xì)胞進(jìn)行紅景天苷培養(yǎng)中，紅景天苷抗缺氧、促血管新生、改善血供等多種藥理作用，能夠刺激了多種細(xì)胞因子的合成分泌，尤其是可能上調(diào)了bFGF、VEGF表達(dá)，通過VEGF能夠誘導(dǎo)血管新生而改善成骨細(xì)胞的供血供氧狀態(tài)，從而對(duì)成骨細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)的作用；而通過bFGF能夠促進(jìn)予MG-63人成骨細(xì)胞的細(xì)胞分裂增殖活性而抵抗其凋亡，并能夠進(jìn)一步促進(jìn)VEGF的合成而有效促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管形成，從而有效促進(jìn)了成骨細(xì)胞的增殖、減少了成骨細(xì)胞的凋亡。此外，本研究中，紅景組組培養(yǎng)1、3 d骨化結(jié)節(jié)數(shù)明顯高于對(duì)照組，表明紅景天苷能夠有效改善MG-63人成骨細(xì)胞的骨化活性。這可能是由于本研究紅景天苷培養(yǎng)中，其具有活血化瘀、通脈止痛之功效，能夠有效上調(diào)bFGF、VEGF等細(xì)胞因子的表達(dá)，有助于誘導(dǎo)血管新生而改善了成骨細(xì)胞的供血供氧狀態(tài)，從而對(duì)成骨細(xì)胞具有保護(hù)作用，使成骨細(xì)胞的凋亡減少，并有助于成骨細(xì)胞的分化成熟，調(diào)節(jié)了骨代謝動(dòng)態(tài)平衡而促進(jìn)了骨形成，并最終骨化形成了骨結(jié)節(jié)組織。

綜上所述，紅景天苷可能通過上調(diào)bFGF、VEGF表達(dá)來抵抗MG-63人成骨細(xì)胞的凋亡，有助于改善MG-63人成骨細(xì)胞的骨化活性，這為全面深入闡明紅景天苷促進(jìn)骨生成的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，應(yīng)能夠?yàn)榧t景天苷防治骨質(zhì)疏松癥提供依據(jù)。