徐磊　盛鵬程　屠仁千　孫博懌

摘要? ? 為了解湖州地區(qū)漁用飼料中抗生素的污染水平，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，對湖州地區(qū)漁用飼料中的土霉素、金霉素、四環(huán)素和強力霉素開展了檢測分析。結(jié)果表明，飼料中四環(huán)素類抗生素的加標(biāo)回收率很低，需要用基質(zhì)加標(biāo)的方法去定量才能保證回收率以滿足試驗要求。在18份飼料樣品中，共有8份飼料樣品中測出1～3種四環(huán)素類抗生素，檢出率為44.4%;其中金霉素的檢測率最高，為33.3%。不同養(yǎng)殖品種所用的飼料中四環(huán)素類抗生素含量存在差異，這一方面與養(yǎng)殖模式有關(guān)，另一方面也與養(yǎng)殖場的管理混亂有關(guān)。

關(guān)鍵詞? ? 漁用飼料;四環(huán)素類抗生素;回收率;污染水平;浙江湖州

中圖分類號? ? S816.7? ? ? ? 文獻標(biāo)識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）09-0217-03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）

Abstract? ? In order to understand the pollution level of antibiotics in fishery feed in Huzhou area，the detection and analysis of oxytetracycline，chlortetracycline，tetracycline and doxycycline in fishery feed in Huzhou area were carried out by using ultra high performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry.The results showed that the recovery rate of tetracycline antibiotics was very low，and it needs to be quantified by matrix addition to ensure that the recovery rate can meet the experimental requirements.Among the 18 feed samples，1-3 kinds of tetracycline antibiotics were detected in 8 feed samples，the detection rate was 44.4%，among which the detection rate of chlortetracycline was the highest（33.3%）.The content of tetracycline antibiotics in the feed of different breed was different.On the one hand，it was related to the breeding mode;on the other hand，it was also related to the management confusion of the farm.

Key words? ? fishery feed;tetracycline antibiotic;recovery rate;pollution level;Huzhou Zhejiang

抗生素是生物（包括微生物、植物和動物）在其生命活動過程中所產(chǎn)生的（或由其他方法獲得的）有機代謝產(chǎn)物，能在低微濃度下選擇性地抑制或影響其他生物的次級代謝產(chǎn)物及其衍生物[1]。其中，四環(huán)素類抗生素（tetracyclines，TCs）是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素[2]，包括金霉素（chlortet-racycline）、土霉素（oxytetracycline）、四環(huán)素（tetracycline）及半合成衍生物甲烯土霉素、強力霉素、二甲胺基四環(huán)素等。作為目前我國生產(chǎn)和使用最廣泛的抗生素之一，四環(huán)素類抗生素被廣泛地運用于水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，其中一種方法便是將抗生素添加到飼料中。

飼料中大量添加四環(huán)素類抗生素會導(dǎo)致藥物在生物體內(nèi)的殘留以及抗藥菌株的產(chǎn)生[3-5]，目前許多國家對飼料中添加四環(huán)素類進行了嚴(yán)格的監(jiān)控[6-7]。我國在2018年4月，由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部印發(fā)《獸用抗菌藥使用減量化行動試點工作方案（2018—2021年）》，力爭通過3年時間，實施養(yǎng)殖環(huán)節(jié)獸用抗菌藥使用減量化行動試點工作，而藥物飼料添加劑計劃將于2020年全部退出。

浙江湖州自古被譽為絲綢之府、魚米之鄉(xiāng)，是我國著名的十大淡水魚養(yǎng)殖基地。漁業(yè)作為湖州農(nóng)業(yè)的首位產(chǎn)業(yè)，2018年漁業(yè)總產(chǎn)值已突破100億元，然而湖州地區(qū)漁用飼料中抗生素的殘留情況研究目前仍是空白。本研究以湖州水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要使用飼料為研究對象，建立一套方便快捷的四環(huán)素類檢測方法，并對四環(huán)素類抗生素的污染水平進行初步分析，以了解飼料中四環(huán)素類抗生素的殘留狀況。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 樣品采集

采集時間為2017年4月，飼料來自于湖州地區(qū)的水產(chǎn)養(yǎng)殖場，采集點分布情況見表1，養(yǎng)殖品種主要選擇的是湖州地區(qū)最主要的養(yǎng)殖品種，采樣點主要分布于東、西苕溪周邊以及南太湖沿岸（圖1）。

1.2? ? 儀器和材料

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（TQ MS/I-CLASS系列，美國Waters公司）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）;氮吹儀（美國Orgnomation公司）;冷凍干燥機（美國Labconco公司）;固相萃取裝置（美國SUPELCO公司）。

鹽酸土霉素（OTC）、鹽酸金霉素（CTC）、鹽酸四環(huán)素（TC）、鹽酸強力霉素（DOX）均來自德國Dr. Ehrensorfer公司。

Oasis HLB 固相萃取小柱（225 mg/Oasis HLB Plus Short cartridges，美國Waters公司）。

SAX陰離子交換小柱（360 mg/Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Short Cartridge，美國Waters公司）。

1.3? ? 樣品處理

顆粒狀的飼料研磨后過20目篩，準(zhǔn)確稱取2.00 g置于50 mL離心管中，加Mcllvaine-Na2EDTA 緩沖溶液20 mL（每1 000 mL緩沖溶液中含檸檬酸水合物12.9 g、磷酸氫二鈉10.9 g、Na2EDTA 37.2 g）。渦旋混勻1 min，搖床振蕩20 min，超聲波提取10 min，離心后收集上清液，殘留物重復(fù)提取1次后，合并2次上清液，混勻后取20 mL過SAX-HLB串聯(lián)小柱。上樣前，SAX-HLB串聯(lián)柱依次用5 mL甲醇、5 mL超純水和5 mL Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液活化平衡;上樣時，將稀釋水樣流速控制在5～8 mL/min;上樣后，將上層SAX柱取下后用10 mL超純水淋洗 HLB 柱，負(fù)壓抽干后置于冷凍干燥機中干燥10 min;最后用6 mL甲醇進行洗脫，收集洗脫液并在40 ℃下用氮氣吹干，用流動相定容至1.0 mL。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 質(zhì)量控制

四環(huán)素類采用外標(biāo)法進行定量分析。以空白飼料為基質(zhì)進行加標(biāo)試驗，2.00 g飼料中分別加入10 ng和50 ng混合標(biāo)準(zhǔn)品，飼料中四環(huán)素類抗生素的回收率為23.5%～45.9%，其中土霉素的回收率最低、四環(huán)素回收率最高?；厥章蔬^低，無法滿足試驗要求。因此，本試驗中的標(biāo)準(zhǔn)曲線采用空白飼料樣品加標(biāo)的方法制備，在2.00 g空白飼料中分別加入2、4、10、25、50、100 μL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1 000 μg/L），與樣品同步處理。4種抗生素標(biāo)準(zhǔn)曲線R2在0.927 633～0.965 244之間，回收率為71.5%～129.4%（表2），滿足試驗要求。以S/N

≥3作為方法的最低檢出限，飼料中四環(huán)素類抗生素的檢出限為0.50～2.00 ng/g（圖2）。

2.2? ? 飼料樣品中抗生素殘留狀況

在采集的18個飼料中，檢測結(jié)果如表3所示，共有8個飼料樣品檢測出1～3種四環(huán)素類抗生素，檢出率為44.4%。4種抗生素中CTC的檢測率最高，為33.3%。其中，S5處青蝦養(yǎng)殖場的飼料中檢測出最高濃度，分別為CTC 2 580.00 ng/g、TC 546.00 ng/g、DOX 425.00 ng/g，遠遠高于其他7個飼料樣品中測出的濃度。由于在水產(chǎn)養(yǎng)殖中四環(huán)素類抗生素主要用于防治魚類的腸炎病、赤皮病等病害，如果人為在飼料中添加，一般添加量在10～100 mg/kg之間才會有治療效果[8]。本研究中S5處飼料測得的四環(huán)素類濃度為0.425～2.580 mg/kg，遠低于一般的添加量，因而可以認(rèn)為飼料中的抗生素并非是養(yǎng)殖戶人為添加的。如果飼料中的抗生素并非是養(yǎng)殖戶人為添加，那么漁用飼料中的抗生素來源一般有2種，一是飼料加工廠的人為添加，二是養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中因管理混亂所導(dǎo)致的污染。S5處飼料應(yīng)該是屬于第2種情況。雖然理論上要求在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中飼料與魚藥要分開存放，但在實際的操作過程中，這一點很容易被養(yǎng)殖戶忽略，當(dāng)飼料與魚藥同時存放在同一個儲藏間內(nèi)，難免會發(fā)生一些交叉污染，從而在飼料中檢測出高濃度的抗生素殘留。

2.3? ? 不同水產(chǎn)養(yǎng)殖品種飼料中的抗生素殘留分析

在9個水產(chǎn)養(yǎng)殖品種中，有6個品種的飼料檢測出含有四環(huán)素類抗生素，其中泥鰍、青蝦的4個飼料中抗生素檢出率為100%。泥鰍作為一種高密度的養(yǎng)殖品種，屬于無鱗魚類，容易發(fā)生腐皮類的病害，四環(huán)素類抗生素在這方面有不錯的效果。青蝦作為湖州地區(qū)的特色產(chǎn)業(yè)，2018年的總產(chǎn)量占浙江省總產(chǎn)量的68%。由于青蝦的養(yǎng)殖密度低，養(yǎng)殖模式也比較簡單，很少發(fā)生病害，在養(yǎng)殖過程中一般不需要投放藥物。S5和S6這2份飼料中檢測出四環(huán)素類抗生素，S5是由于飼料被污染導(dǎo)致的，S6應(yīng)該是在飼料的生產(chǎn)過程中加入的，至于原因，仍需要進一步調(diào)查。

從表4可以看出，外塘甲魚飼料中含有的四環(huán)素類抗生素最多，另外有3個品種中未測出抗生素，分別是溫室甲魚、青魚和烏鱧。有研究表明，在溫室甲魚的池塘水中可以檢測出多組分、高濃度的抗生素，其中就包含有四環(huán)素類抗生素[8]。本研究中的2個溫室甲魚飼料樣品中均未檢測出四環(huán)素類抗生素，一方面是因為檢測的飼料樣品批次過少;另一方面可能是因為在溫室甲魚的養(yǎng)殖過程中，主要預(yù)防肺炎和出血病，一般用的比較多的藥物是頭孢類和氧氟沙星，四環(huán)素類抗生素并非是主要用藥。青魚的養(yǎng)殖周期比較長，一般養(yǎng)殖密度也不會很大，所以養(yǎng)殖過程中病害相對較少，對于藥物的依賴性比較低。烏鱧是一個高密度的養(yǎng)殖品種，近些年以來，隨著對漁業(yè)環(huán)境的越發(fā)重視，導(dǎo)致地方一直在推廣投喂飼料的養(yǎng)殖模式，但這種模式卻始終有弊端，在養(yǎng)殖后期烏鱧的畸形率明顯高于投喂冰鮮的養(yǎng)殖模式。因此，有不少養(yǎng)殖戶仍然在延用以前投喂冰鮮的養(yǎng)殖模式或者是混合投喂的養(yǎng)殖模式（前期投喂飼料，后期投喂雞肝、鴨肝等冰鮮），所以烏鱧在養(yǎng)殖過程中對飼料的依賴性比較低，這可能是烏鱧飼料中抗生素濃度低的一個原因。

由此可見，飼料中的抗生素含量與水產(chǎn)品的養(yǎng)殖模式密切相關(guān)，包括投喂方式、病害情況、用藥習(xí)慣等。

3? ? 結(jié)論與討論

本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中的四環(huán)素類抗生素，當(dāng)以空白飼料為基質(zhì)進行加標(biāo)試驗時，4種四環(huán)素類抗生素的回收率均很低，無法滿足試驗要求。本研究最終采用在空白飼料樣品中加標(biāo)的方法制備抗生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線用于定量，4種四環(huán)素類抗生素的回收率可以達到71.5%～124.9%。

在采集的18個飼料中，共有8種飼料樣品中測出1～3 種四環(huán)素類抗生素，檢出率為44.4%。檢測出最高濃度分別為CTC（2 580 ng/g）、TC（546 ng/g）、DOX（425 ng/g）。這應(yīng)該是養(yǎng)殖過程中管理混亂所導(dǎo)致的交叉污染現(xiàn)象。因此，在養(yǎng)殖過程中，應(yīng)當(dāng)加強管理，嚴(yán)禁將飼料與魚藥放在同一個儲藏間內(nèi)。

不同飼料中的抗生素殘留差距較為明顯，飼料中的抗生素含量與水產(chǎn)品的養(yǎng)殖模式密切相關(guān)，包括投喂方式、病害情況、用藥習(xí)慣等。

4? ? 參考文獻

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