劉苑皓，趙興秀，舒梨，何義國

(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000)

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是一種化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定并廣泛存在于植物、菌類、昆蟲及哺乳動物體內(nèi)的氧化還原酶[1]。在有氧條件下，單酚類化合物羥基化反應(yīng)生成兒茶酚，兒茶酚脫氫反應(yīng)后與O2結(jié)合形成醌并自發(fā)發(fā)生非酶反應(yīng)在水中聚合，最終形成水不溶性聚合物而被除去[2]。游離酶在水溶液中有穩(wěn)定性差、易流失、不可回收等缺點(diǎn)，導(dǎo)致處理成本過高，限制了其實(shí)際應(yīng)用[3]。同時(shí)，100余種真菌產(chǎn)多酚氧化酶統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，絕大部分酶作用的最適pH在3.0～5.0之間[4]，而工業(yè)染料廢水一般呈現(xiàn)高溫、高pH和高鹽等特點(diǎn)[5]。酶在此條件下容易因劇烈的外部環(huán)境導(dǎo)致活性部位結(jié)構(gòu)失活變性，無法起到催化作用。固定化酶(immobilized enzyme)是指利用物理或者化學(xué)手段固定在載體上或者束縛在一定區(qū)域內(nèi)保持催化活性并能連續(xù)反應(yīng)和反復(fù)使用的酶制劑[6]。固定化酶的優(yōu)點(diǎn)主要是熱穩(wěn)定性好，在堿性條件下具有較好的穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性且能夠?qū)崿F(xiàn)多次重復(fù)利用等[7]。

在實(shí)際應(yīng)用中，Yagüe 等研究了PPO降解高單寧含量的啤酒工業(yè)廢水的能力，熱解氣相質(zhì)譜分析顯示多酚熱解產(chǎn)物(主要是苯酚和鄰甲基苯酚)都有所降低[8]。但未經(jīng)過固定化的酶存在穩(wěn)定性差、易流失、不能重復(fù)利用等缺點(diǎn)，導(dǎo)致處理成本過高。油橄欖壓榨廢水(OMW)是生產(chǎn)橄欖油工業(yè)中特有的副產(chǎn)物，Alessandro采用固定化PPO處理OMW，可以脫除多酚聚合物，如兒茶酚和二羥基苯乙烯酸的脫除率分別達(dá)到了95%和 99%，還能促進(jìn) OMW流體的部分脫色及降低污水毒性[9]。同時(shí)固定化提高了酶的穩(wěn)定性，使酶多次重復(fù)利用，降低了處理成本[10]。

以海藻酸鈉包埋法(polyphenol oxidase immobilized by sodium alginate,A-PPO)和戊二醛交聯(lián)法(polyphenol oxidase immobilized by glutaraldehyde crosslinking, C-PPO)兩種固定化方法制備固定化多酚氧化酶。海藻酸鈉包埋法中將戊二醛的使用次序提前到酶液與海藻酸鈉混合振蕩過程中，使多酚氧化酶與戊二醛之間能夠形成化學(xué)鍵穩(wěn)定結(jié)合，以期能有更好的固定化效果。戊二醛交聯(lián)法中，采用成本低廉的戊二醛作為交聯(lián)劑，使戊二醛與酶和載體之間都能夠形成穩(wěn)定的化學(xué)鍵來提高固定化效果。試驗(yàn)考察了固定化酶的最佳制備條件及其酶學(xué)性質(zhì)，比較了固定化方法對固定化酶性質(zhì)的影響，為利用固定化酶處理食品工業(yè)廢水提供了一定的理論數(shù)據(jù)參考。

1 材料與儀器

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)、海藻酸鈉(sodium alginate，SA)、殼聚糖(chitosan，CTS )：購于Bomei(USA)公司；鈉基蒙脫土(montmorillonite，MMT)： 購于浙江三鼎科技有限公司；戊二醛(50%)：分析純，購于南京化學(xué)試劑股份有限公司；其他試劑：均為分析純。

TG-16型醫(yī)用離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司；201-3AB型電熱恒溫干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；HH-6B型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州普天儀器制造有限公司；SHZ-A型水浴恒溫振蕩器 上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；V-1000型可見分光光度計(jì) 翱藝儀器(上海)有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 游離酶酶活測定

將多酚氧化酶母液(1 mg/mL)稀釋至10 mg/L，取1 mL 10 mg/L多酚氧化酶液加入到12 mL鄰苯二酚溶液(10 mmol/L)中，在25 ℃條件下反應(yīng)5 min，在410 nm波長下測定其吸光度，以1 mL pH 6.8磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)作空白對照。在410 nm吸光度下每毫升樣品每分鐘變化0.001為一個(gè)酶活單位U[11]。固定酶活以每組最高吸光度為100%酶活，其余值與最高值的百分比為相對酶活。

2.2 海藻酸鈉包埋法

將一定量海藻酸鈉與pH 6.8 PBS混合，60 ℃加熱溶化，冷卻至室溫后備用；將10 mg/L多酚氧化酶液與海藻酸鈉按照體積比1∶1混合振蕩，添加少量戊二醛(體積分?jǐn)?shù)4%)，常溫振蕩40 min。用注射器吸取上述混合液，勻速滴入氯化鈣溶液中，形成海藻酸鈉凝膠珠；更換氯化鈣溶液，將凝膠珠置于氯化鈣溶液中4 ℃環(huán)境下硬化2 h，濾出凝膠珠，蒸餾水洗滌數(shù)次，4 ℃貯存?zhèn)溆肹12]。

2.2.1 單因素試驗(yàn)

2.2.1.1 海藻酸鈉濃度對A-PPO酶活力的影響

設(shè)置海藻酸鈉的濃度分別為1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，CaCl2溶液濃度為2%(V/V)，制備A-PPO，測定酶活。

2.2.1.2 CaCl2濃度對A-PPO酶活力的影響

設(shè)置CaCl2的濃度分別為1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，海藻酸鈉溶液濃度為2%，制備A-PPO，測定酶活。

2.2.1.3 硬化固定時(shí)間對A-PPO酶活力的影響

設(shè)置固定化時(shí)間分別為1，2，3，4 h。海藻酸鈉溶液濃度為2%，CaCl2溶液濃度為2%，制備A-PPO，測定酶活。

2.2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)2.2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果，得到正交試驗(yàn)因素水平，見表1。

表1 A-PPO正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Orthogonal experimental factors and levels of A-PPO

按照正交表設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)制定L9(33)正交試驗(yàn)方案，參考其結(jié)果進(jìn)一步完善A-PPO的制備方案。

2.3 戊二醛交聯(lián)法

2.3.1 蒙脫土/殼聚糖插層復(fù)合物的制備

稱取3.3 g殼聚糖置于250 mL乙酸溶液(體積分?jǐn)?shù)1%)中，室溫?cái)嚢?，緩慢加入NaOH溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%)，用pH計(jì)檢測調(diào)節(jié)pH到4.9。稱取4.0 g蒙脫土于100 mL蒸餾水中攪拌溶脹2 h，再將其在恒溫水浴鍋中預(yù)熱至60 ℃，待預(yù)熱完成后將殼聚糖緩慢滴入蒙脫土懸液中攪拌，靜置6 h，5000 r/min離心8 min，傾倒廢液后將產(chǎn)物用蒸餾水洗滌至上清液呈中性并于60 ℃烘干，在研缽中將殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合材料研磨至200目，在干燥皿中保存?zhèn)溆肹13]。

2.3.2 戊二醛交聯(lián)多酚氧化酶

將0.02 g CTS/MMT插層復(fù)合物加入到10 mL 1.0%戊二醛溶液中，30 ℃振蕩交聯(lián)2 h，交聯(lián)完成后用蒸餾水洗滌抽濾，用PBS(0.05 mol/L，pH 7.0)反復(fù)洗滌至上清液中無戊二醛殘留，再次抽濾，于60 ℃干燥后備用。取2 mL多酚氧化酶酶液(0.1 mg/mL，pH 4.0)加入CTS/MMT插層復(fù)合物中，室溫下振蕩固定6.5 h。固定化完成后以8000 r/min離心10 min，抽濾，用PBS(0.05 mol/L，pH 7.0)反復(fù)洗滌，離心抽濾，直至上清液中檢測不到PPO，常溫干燥過夜，制成C-PPO[14]。

2.3.3 殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物表征分析

制備得到的殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物需要進(jìn)行表征分析，用以確定插層的效果以及確定其能否作為固定化酶的載體使用。

2.3.3.1 X-射線衍射(X-RD)分析

X射線衍射(X-RD)圖譜采用Cukα輻射源，管電壓40 kV，管電流500 mA，掃描范圍3°～40°[15]。

2.3.3.2 紅外光譜法

紅外光譜法采用Nicolet-iNIO+iZIO FTIR顯微紅外光譜儀記錄，KBr壓片法，掃描范圍4000～500 cm-l。

2.3.4 單因素優(yōu)化

2.3.4.1 戊二醛濃度對C-PPO酶活力的影響

取5份CTS/MMT插層復(fù)合物各0.0133 g，將CTS/MMT插層復(fù)合物與濃度分別為0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%的戊二醛溶液混合，30 ℃振蕩交聯(lián)2 h，余下操作同2.3.2。分別取5份 1 mL 0.1 mg/mL PPO酶液(pH 4.0)加入CTS/MMT插層復(fù)合物，常溫振蕩固定6 h制備不同戊二醛濃度的C-PPO。

2.3.4.2 振蕩固定pH對C-PPO酶活力的影響

取5份pH分別為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 (0.1 mg/mL)PPO酶液到5份質(zhì)量為0.0133 g攪拌交聯(lián)干燥的CTS/MMT插層復(fù)合物中(操作同2.3.2)，制成不同振蕩固定pH的C-PPO。

2.3.4.3 酶與載體質(zhì)量比對C-PPO酶活力的影響

取5份1 mL(0.1 mg/mL)PPO酶液(pH 4.0)加入5份質(zhì)量分別為0.0154，0.0143，0.0133，0.0125，0.0118 g 攪拌交聯(lián)干燥的CTS/MMT插層復(fù)合物中(操作同2.3.2)，制成不同酶與載體質(zhì)量比的C-PPO。

2.3.4.4 固定化反應(yīng)時(shí)間對C-PPO酶活力的影響

取5份1 mL(0.1 mg/mL)PPO酶液(pH 4.0)加入到攪拌交聯(lián)干燥的C-PPO中，常溫振蕩固定時(shí)間分別為3，4，5，6，7 h，制備不同固定化時(shí)間的C-PPO。

2.3.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)2.3.4單因素試驗(yàn)結(jié)果，得到正交試驗(yàn)因素水平，見表2。

表2 C-PPO正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Orthogonal experimental factors and levels of C-PPO

按照正交表設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)制定L9(33)正交試驗(yàn)方案，參考其結(jié)果進(jìn)一步完善C-PPO的制備方案。

2.4 游離及固定化酶酶學(xué)性質(zhì)探究

酶學(xué)性質(zhì)的探究是關(guān)于游離多酚氧化酶和兩種不同方法固定化多酚氧化酶關(guān)于pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、貯藏穩(wěn)定性和固定化酶重復(fù)使用率的探究，以及總蛋白含量和米氏常數(shù)的測定[16]，在測定游離酶及固定化酶酶活力過程中所涉及的反應(yīng)溫度、pH參考文獻(xiàn)[17,18]。

2.4.1 游離及固定化酶的單因素優(yōu)化

2.4.1.1 pH穩(wěn)定性

分別取0.005 g C-PPO固體、游離PPO 1 mL(0.1 mg/mL)、A-PPO 1 mL各5份分別置于pH值為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0的緩沖溶液中2 h，固定化酶用pH 6.8的PBS洗滌至中性，抽濾常溫干燥，測定酶活。

2.4.1.2 熱穩(wěn)定性

取0.005 g C-PPO固體、游離PPO 1 mL(0.1 mg/mL)、A-PPO 1 mL各5份分別置于20，30，40，50 ℃ 4個(gè)環(huán)境溫度下2 h，冷卻至室溫，測定酶活。

2.4.1.3 貯藏穩(wěn)定性

將同批次制備的C-PPO固體0.005 g、游離PPO 1 mL(0.1 mg/mL)、A-PPO 1 mL各5份于4 ℃避光保存，分別在0，5，10，15，20，25 d測定酶活。

2.4.1.4 重復(fù)使用率測定

取0.005 g C-PPO固體、A-PPO 1 mL測定酶活，測定后用pH 6.8 的PBS洗滌抽濾，再次測定，反復(fù)操作，至測得相對酶活低于50%停止。

2.4.2 固定化率測定

配制考馬斯亮藍(lán)溶液及1 mg/mL牛血清蛋白，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[19]。分別取C-PPO固體0.005 g、游離PPO 1 mL(0.1 mg/mL)、A-PPO 1 mL測定A595 nm處的吸光度值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算各樣品的蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)。

2.4.3 米氏常數(shù)測定

配制濃度為5，10，15，20，25 mmol/L的鄰苯二酚溶液，取0.005 g C-PPO固體、游離PPO 1 mL(0.1 mg/mL)、A-PPO 1 mL各5份，參照2.3.2、2.2、2.1中測定酶活操作添加試劑，每分鐘測定一次吸光度，每組測定5次，對5次測定值作散點(diǎn)圖，以趨勢線斜率為反應(yīng)速度，分別以[1/V]為橫坐標(biāo)、[1/S]為縱坐標(biāo)作圖，得到Lineweaver-Burk方程，直線橫截距為-1/Km，縱截距為1/Vmax[20]。

2.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)操作重復(fù)3次，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，采用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 海藻酸鈉包埋法結(jié)果

3.1.1 CaCl2濃度對A-PPO酶活力的影響

圖1 CaCl2濃度對A-PPO酶活力的影響Fig.1 Effect of CaCl2 concentration on A-PPO enzymatic activity

由圖1可知，在制備過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CaCl2濃度為1.5%時(shí)，制備的凝膠珠成型效果較差，導(dǎo)致測定酶活時(shí)易破裂。在CaCl2濃度達(dá)到3%時(shí)，凝膠珠外部的CaCl2易溶解在水相中，A-PPO在CaCl2濃度為1.5%和3%時(shí)相對酶活數(shù)值較高，實(shí)質(zhì)上是因?yàn)镃aCl2釋放溶解在水相中，導(dǎo)致測定值偏高，不具有參考性。只有當(dāng)CaCl2濃度為2.5%左右時(shí)，形成的凝膠珠形狀固定保存時(shí)間較長，相對酶活較高。

3.1.2 海藻酸鈉濃度對A-PPO酶活力的影響

圖2 海藻酸鈉濃度對A-PPO酶活力的影響Fig.2 Effect of sodium alginate concentration on A-PPO enzymatic activity

由圖 2可知，在制備過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)海藻酸鈉濃度大于2.5%時(shí)，凝膠珠粘度過大，導(dǎo)致凝膠珠成型緩慢且形狀不規(guī)則。而當(dāng)海藻酸鈉濃度在1.5%左右時(shí)，雖然凝膠珠成型較快且形狀規(guī)則，但是交聯(lián)后的成珠效果不好，多數(shù)凝膠珠有破裂現(xiàn)象，這是因?yàn)楹Ｔ逅徕c濃度過低，導(dǎo)致凝膠珠粘度低，物理強(qiáng)度小，無法有效形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。海藻酸鈉濃度在2.0%時(shí)，A-PPO的相對酶活較高且凝膠珠成型速度適中、形狀規(guī)則、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能夠有效包埋多酚氧化酶。

3.1.3 固定化時(shí)間對A-PPO酶活力的影響

圖3 固定化時(shí)間對A-PPO酶活力的影響Fig.3 Effect of immobilization time on A-PPO enzymatic activity

由圖 3可知，固定化3 h的A-PPO相對酶活比固定化2 h的降低30%。低溫環(huán)境有利于CaCl2硬化，但是固定化時(shí)間越長，凝膠珠硬化效果越好，可能會導(dǎo)致固定化酶的空間位阻越大，酶與底物的接觸減少，酶活降低，另一個(gè)原因可能是固定化時(shí)間過長導(dǎo)致酶的部分結(jié)構(gòu)改變，活性降低。因此，選擇固定化2 h繼續(xù)后續(xù)試驗(yàn)。

3.1.4 正交分析

表3 海藻酸鈉包埋法正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 3 The results of orthogonal experiment for sodium alginate embedding method

續(xù) 表

由表 3可知，最佳試驗(yàn)組合為試驗(yàn)號6，因素條件為2.0% CaCl2、2.5%海藻酸鈉、固定化時(shí)間2 h。參照方差分析中的極差順序排列可知各單因素對A-PPO酶活力大小影響的順序?yàn)镃aCl2濃度>固定化時(shí)間>海藻酸鈉濃度，各單因素的最優(yōu)值分別為2.5% CaCl2、2.5%海藻酸鈉、固定化時(shí)間2 h。最終確定最優(yōu)組合為2.5% CaCl2、2.5%海藻酸鈉和固定化時(shí)間2 h。

3.2 戊二醛交聯(lián)法

3.2.1 殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物表征分析

圖4 CTS/MMT(a)、蒙脫土(MMT)(b)、 殼聚糖(CTS)(c)X-RD圖譜Fig.4 X-RD chromatograms of CTS/MMT(a), montmorillonite (MMT)(b) and chitosan(CTS)(c)

由圖4可知，殼聚糖/蒙脫土復(fù)合插層物在2θ=5.62°出現(xiàn)特征衍射峰，蒙脫土在2θ=5.66°出現(xiàn)特征峰值，由Bragg方程(2dsinq=l，d表示硅酸鹽片層間的平均距離，l表示入射X射線的波長，l=0.15416 nm)得出殼聚糖/蒙脫土復(fù)合插層物和蒙脫土的層間距分別為1.57 nm和1.55 nm，蒙脫土層間距增加，說明形成了插層結(jié)構(gòu)。

圖5 CTS/MMT(b)、蒙脫土(MMT)(a)、 殼聚糖(CTS)(c)紅外光譜圖Fig.5 IR spectra of CTS/MMT(b)，montrnorillonite (MMT)(a)and chitosan(CTS)(c)

由圖 5可知，蒙脫土在3619 cm-1處出現(xiàn)O-H的伸縮振動吸收峰，在3429 cm-1處出現(xiàn)吸收峰是由于層內(nèi)和層內(nèi)氫鍵的伸縮振動；在1637 cm-1處出現(xiàn)H-O-H的伸縮振動吸收峰；在1034 cm-1處出現(xiàn)Si-O伸縮振動吸收峰；在916 cm-1和623 cm-1處吸收峰為Al-OH的伸縮振動。在殼聚糖圖譜中，由于O-H和N-H伸縮帶的重疊在3436 cm-1處出現(xiàn)吸收峰。在2921 cm-1處的吸收峰為非芳香族的C-H的伸縮振動，在1605 cm-1吸收峰為N-H的彎曲，在1383 cm-1吸收峰為C-H的彎曲，在1151 cm-1和1087 cm-1為C-O的伸縮振動。在蒙脫土/殼聚糖插層復(fù)合物紅外光譜中保留了部分殼聚糖和蒙脫土的伸縮振動吸收峰，在3622 cm-1和3430 cm-1處存在O-H的伸縮振動吸收峰，在2922 cm-1處吸收峰為鏈狀烴基C-H變形振動，同時(shí)，由于殼聚糖的N-H彎曲振動與蒙脫土的H-O-H伸縮振動是殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物波峰向低峰處移動，在1517 cm-1處出現(xiàn)吸收峰，結(jié)果表明殼聚糖與蒙脫土片層間發(fā)生了插層，形成了插層復(fù)合物。因此，該殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物可以用于多酚氧化酶的固定。

3.2.2 戊二醛濃度對C-PPO酶活力的影響

圖6 戊二醛濃度對C-PPO酶活力的影響Fig.6 Effect of glutaraldehyde concentration on C-PPO enzymatic activity

由圖 6可知，在戊二醛濃度低于1.25%時(shí)，C-PPO的相對酶活隨著戊二醛濃度的增大而上升；在戊二醛濃度達(dá)到1.25%時(shí)，相對酶活達(dá)到最大；在戊二醛濃度大于1.25%之后，C-PPO酶活力開始下降，這是因?yàn)槲於┍旧砣┗哂休^大的范德華力，與殼聚糖形成共價(jià)鍵的游離醛基可與酶上的-OH、-NH3等基團(tuán)共價(jià)結(jié)合形成共價(jià)鍵，導(dǎo)致酶蛋白所含有的有效基團(tuán)被占用無法與底物有效結(jié)合，催化底物的氧化變化，導(dǎo)致C-PPO的酶活力降低。當(dāng)戊二醛濃度在1.00%～1.50%時(shí)，C-PPO的相對酶活相差較小，因此設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)時(shí)將戊二醛濃度因素設(shè)置3個(gè)水平梯度1.00%、1.25%、1.50%。

3.2.3 pH值對C-PPO酶活力的影響

圖7 固定化pH對C-PPO酶活力的影響Fig.7 Effect of immobilization pH on C-PPO enzymatic activity

由圖 7可知，在多酚氧化酶固定化過程中，C-PPO的酶活力受到固定化pH的影響較大。在固定化pH低于4.0時(shí)C-PPO的相對酶活僅為14%左右，這是因?yàn)檫^酸環(huán)境中大量的H+與酶和CTS/MMT插層復(fù)合物中的-OH結(jié)合，占用載體中的基團(tuán)，同時(shí)，過酸環(huán)境對酶本身的結(jié)構(gòu)和CTS/MMT插層復(fù)合物內(nèi)部結(jié)構(gòu)及其與戊二醛的交聯(lián)共價(jià)鍵造成破壞，降低了酶的催化能力和CTS/MMT插層復(fù)合物對酶蛋白的固定能力。在固定化pH大于4.0之后，C-PPO的相對酶活一直呈現(xiàn)下降趨勢，這是由于多酚氧化酶本身適用于偏酸環(huán)境反應(yīng)，隨著pH增大，固定化環(huán)境中的OH-增多，破壞酶蛋白本身的結(jié)構(gòu)并且作為抑制劑使酶出現(xiàn)鈍化現(xiàn)象。由于pH對酶蛋白的結(jié)構(gòu)和活性影響較大，且對CTS/MMT插層復(fù)合物的結(jié)構(gòu)有影響，因此在設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)時(shí)應(yīng)使pH值之間的梯度盡可能小，因此設(shè)計(jì)固定化pH值為3.5，4.0，4.5。

3.2.4 酶與載體質(zhì)量比對C-PPO酶活力的影響

圖8 酶與載體質(zhì)量比對C-PPO酶活力的影響Fig.8 Effect of the mass ratio of enzyme to carrier on C-PPO enzymatic activity

由圖8可知，C-PPO的酶活力受酶與載體質(zhì)量比的影響不是很大，在酶與載體質(zhì)量比低于80(mg/g)，C-PPO的相對酶活隨著酶與載體質(zhì)量比的增大而緩慢上升，這是因?yàn)槎喾友趸傅牧可形催_(dá)到CTS/MMT插層復(fù)合物對酶蛋白固定的飽和值，因此隨著酶量的增大，C-PPO的相對酶活梯次上升。當(dāng)酶與載體質(zhì)量比大于80 (mg/g)之后，C-PPO的相對酶活反而呈現(xiàn)下降趨勢，這是因?yàn)橘|(zhì)量一定的CTS/MMT插層復(fù)合物上酶的結(jié)合固定位點(diǎn)的數(shù)目一定，當(dāng)酶與載體質(zhì)量比大于80 (mg/g)之后，這些結(jié)合位點(diǎn)出現(xiàn)過飽和現(xiàn)象，同一個(gè)載體位點(diǎn)因?yàn)橛羞^多的酶蛋白存在而減少了酶與底物接觸的表面積，酶的催化作用受到抑制，因而出現(xiàn)了酶量增加相對酶活反而降低的現(xiàn)象。由于測定酶與載體質(zhì)量比對C-PPO酶活力的影響試驗(yàn)中各組相對酶活始終保持在90%以上，其對C-PPO酶活力的影響較小，因此設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)方案時(shí)設(shè)定酶與載體質(zhì)量比的3個(gè)水平為75，80，85(mg/g)。

3.2.5 固定化反應(yīng)時(shí)間對C-PPO酶活力的影響

圖9 固定化反應(yīng)時(shí)間對C-PPO酶活力的影響Fig.9 Effect of immobilization time on C-PPO enzymatic activity

由圖9可知，在固定化反應(yīng)時(shí)間小于6.0 h時(shí)，C-PPO的酶活力隨著固定化反應(yīng)時(shí)間的增大而逐漸上升，這是因?yàn)楣潭ɑ磻?yīng)過程中的交聯(lián)鍵固定反應(yīng)尚未完成，隨著固定化反應(yīng)間的增大，酶的固定量逐漸上升并趨于飽和，使C-PPO的相對酶活逐漸上升。當(dāng)固定化反應(yīng)時(shí)間大于6.0 h之后，C-PPO的相對酶活開始略有下降，這可能是因?yàn)楣潭ɑ磻?yīng)時(shí)間過長，持續(xù)的振蕩使部分固定不牢的酶蛋白掉落，C-PPO的酶含量低于飽和酶量。固定化反應(yīng)時(shí)間在6.0～7.0 h時(shí)，C-PPO的相對酶活始終保持在90%以上，可見固定化反應(yīng)時(shí)間在6.0～7.0 h時(shí)對C-PPO酶活力的影響基本一致，因此設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)時(shí)固定化反應(yīng)時(shí)間的3個(gè)水平分別設(shè)為6.0，6.5，7.0 h。

3.2.6 正交試驗(yàn)分析

表4 戊二醛交聯(lián)法正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 4 The results of orthogonal experiment for glutaraldehyde crosslinking method

由表 4可知，最優(yōu)水平組合為試驗(yàn)號6，其因素組合為1.25%戊二醛、振蕩固定pH 4.5、酶與載體質(zhì)量比75(mg/g)、固定化反應(yīng)時(shí)間6.5 h。參照方差分析中極差順序可知，4個(gè)單因素對C-PPO酶活力影響的主次順序依次為振蕩固定pH>振蕩固定時(shí)間>戊二醛濃度>酶與載體質(zhì)量比。各單因素的最優(yōu)值分別為1.25%戊二醛、振蕩固定pH 4.5、酶與載體質(zhì)量比80 (mg/g)、固定化反應(yīng)時(shí)間6.5 h。依次參考直觀分析和因素指標(biāo)，確定四因素三水平正交試驗(yàn)最優(yōu)組合為1.25%戊二醛、振蕩固定pH 4.5、酶與載體質(zhì)量比75(mg/g)、固定化反應(yīng)時(shí)間6.5 h。

3.3 酶學(xué)性質(zhì)的探究

3.3.1 pH穩(wěn)定性

圖10 游離及固定化酶pH穩(wěn)定性探究Fig.10 Study on pH stability of free enzyme and immobilized enzymes

由圖10可知，游離酶與兩種固定化酶的pH穩(wěn)定性差距較大，游離酶在環(huán)境pH為5.0～7.0之間始終保持90%以上的相對酶活，說明多酚氧化酶本身的結(jié)構(gòu)性質(zhì)都比較穩(wěn)定，且最適的保存環(huán)境應(yīng)是中性及弱酸性環(huán)境，這也解釋了自然界中多酚氧化酶的來源遍及各種植物、哺乳動物、昆蟲和真菌。海藻酸鈉包埋法制備的A-PPO僅在環(huán)境pH為6.0～8.0時(shí)能夠保持60%以上的相對酶活，與游離酶相比，其pH穩(wěn)定性反而降低。海藻酸鈉中含有大量的-COO-結(jié)構(gòu)，酸性條件下轉(zhuǎn)化為-COOH，抑制酶蛋白的活性，由此可見海藻酸鈉包埋法制備固定化酶對酶的pH穩(wěn)定性有抑制作用。戊二醛交聯(lián)法制備的C-PPO在環(huán)境pH為4.0～8.0時(shí)均可保持50%以上的相對酶活，可見C-PPO的pH穩(wěn)定性相比游離酶已經(jīng)大幅提高，這是因?yàn)槲於┲械娜┗鶎+和OH-有一定的中和能力，同時(shí)也因?yàn)镃TS/MMT插層復(fù)合物與酶蛋白的結(jié)合減少了外界離子的進(jìn)入，維持了微環(huán)境pH的相對穩(wěn)定。

3.3.2 熱穩(wěn)定性

圖11 游離酶及固定化酶熱穩(wěn)定性探究Fig.11 Study on thermostability of free enzyme and immobilized enzymes

由圖 11可知，將游離及固定化酶分別在15～40 ℃的6個(gè)梯度溫度下保存2 h，測定酶活。游離酶僅在25～35 ℃時(shí)可以保持較高活性，當(dāng)溫度低于25 ℃或者高于35 ℃時(shí)酶活性大幅下降，這是由于低溫抑制其基團(tuán)活性，而高溫則破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使酶失活。海藻酸鈉包埋法制備的A-PPO在15～40 ℃均保持40%以上的相對酶活，可見固定化酶由于酶與載體之間的結(jié)合能夠有效提高其熱穩(wěn)定性，有利于酶在較高溫度的環(huán)境下依舊保持其酶活力。戊二醛交聯(lián)法制備的C-PPO在15～40 ℃均能保持80%以上的相對酶活，可見此法固定多酚氧化酶對酶的熱穩(wěn)定性提高作用遠(yuǎn)大于海藻酸鈉包埋法。海藻酸鈉制備的凝膠珠中水是熱的良導(dǎo)體，無法將內(nèi)部環(huán)境與外界熱源隔離開，而C-PPO由于酶的基團(tuán)與CTS/MMT插層復(fù)合物之間的共價(jià)結(jié)合，有效提高了酶對環(huán)境溫度變化的適應(yīng)能力，提高了其熱穩(wěn)定性。

3.3.3 貯存穩(wěn)定性

圖12 游離酶及固定化酶貯存穩(wěn)定性探究Fig.12 Study on storage stability of free enzyme and immobilized enzymes

由圖 12可知，游離酶與C-PPO的貯存穩(wěn)定性基本一致，在-4 ℃保存15 d時(shí)依舊能夠保持40%以上的相對酶活。A-PPO約在12 d時(shí)能夠保持40%以上的酶活力，在15 d之后反而出現(xiàn)上升趨勢，實(shí)際上是因?yàn)楹Ｔ逅徕c凝膠珠外面的CaCl2溶解，導(dǎo)致在A410 nm處測定吸光度時(shí)由于鄰苯二酚溶液渾濁測定值較真實(shí)值偏大。綜合來看，A-PPO在0～12 d時(shí)間內(nèi)的貯藏穩(wěn)定性優(yōu)于游離酶和C-PPO，但是在12 d之后因?yàn)镃aCl2溶解凝膠珠破裂釋放多酚氧化酶等原因使其貯藏穩(wěn)定性快速下降，導(dǎo)致相對酶活迅速降低，這表明短期貯存12 d海藻酸鈉包埋法固定酶的貯存穩(wěn)定性更好，時(shí)間延長則戊二醛交聯(lián)法固定酶的貯存穩(wěn)定性更好。總的來講，固定化酶本身已經(jīng)消耗大部分酶活力，短期貯存導(dǎo)致其相對酶活的持續(xù)降低將會大大增加在工業(yè)領(lǐng)域投入應(yīng)用的難度。

3.3.4 重復(fù)使用次數(shù)測定

圖13 固定化酶重復(fù)使用次數(shù)的測定Fig.13 Determination of reuse times of immobilized enzymes

由圖13可知，固定化酶確實(shí)可以多次使用，但是不同固定化方法導(dǎo)致其使用次數(shù)不盡相同。海藻酸鈉包埋法制備的A-PPO在第2次使用時(shí)其相對酶活已降低到50%以下，可見其重復(fù)利用的效率并不高，主要是因?yàn)楹Ｔ逅徕c形成的凝膠珠并不具備較高的物理強(qiáng)度，使用1次之后便會破裂，導(dǎo)致內(nèi)部固定的酶流失。由此可見，海藻酸鈉包埋法由于載體本身的物理強(qiáng)度過低，不適合作為固定化酶的主要材料。

戊二醛交聯(lián)法制備的C-PPO在第4次使用時(shí)依舊保持50%以上的相對酶活，可見其固定化效果較好，重復(fù)使用率也相對較高，這得益于CTS/MMT插層復(fù)合物本身的物理強(qiáng)度較高，戊二醛的交聯(lián)作用有效固定酶蛋白，使C-PPO能夠達(dá)到固定化以提高其使用次數(shù)。

3.3.5 固定化率測定

以標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)吸光值為縱坐標(biāo)，測得考馬斯亮藍(lán)G250標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=8.6429x+0.0649(R2=0.9901)。通過回歸方程計(jì)算游離酶及固定化酶的總蛋白含量，見表5。

表5 游離及固定化酶總蛋白量Table 5 Total protein content of free and immobilized enzymes

A-PPO比活力為游離酶的一半左右，這是由于被包埋法固定住的酶與底物的接觸面積減少，戊二醛與酶的部分基團(tuán)之間形成化學(xué)鍵，降低了酶活性。C-PPO比活力為游離酶的43%，一方面是由于多酚氧化酶被固定于插層物的微小空間中，與底物的接觸面積減??；另一方面是因?yàn)槲於┱加昧瞬糠只钚曰鶊F(tuán)。A-PPO與C-PPO的總酶活都僅有游離酶的1/10左右，一方面是因?yàn)楣潭ɑ噶可儆谟坞x酶；另一方面是由于上述兩種原因?qū)γ富钚缘南拗啤?/p>

海藻酸鈉包埋法的酶活回收率為18.6%，戊二醛交聯(lián)法的酶活回收率為24.0%，可見戊二醛交聯(lián)固定酶的能力較好。海藻酸鈉包埋法是通過海藻酸鈉形成凝膠珠時(shí)將液相中的多酚氧化酶固定，其固定酶量取決于酶溶液的濃度，而戊二醛交聯(lián)法是通過戊二醛分別與酶和載體之間形成的化學(xué)鍵將多酚氧化酶固定在殼聚糖與蒙脫土插層形成的微小空間內(nèi)，此法固定酶量取決于殼聚糖與蒙脫土的插層效果。測定固定化酶量在制備A-PPO和C-PPO時(shí)酶液的濃度和用量都保持一致，可見通過形成化學(xué)鍵能夠更好地固定酶。

3.3.6 米氏常數(shù)測定

圖14 游離及固定化酶Lineweaver-burk圖Fig.14 Lineweaver-burk figure of free and immobilized enzymes

由圖 14可知，以游離及固定化酶米氏常數(shù)測定所作Lineweaver-burk圖中的公式計(jì)算截距，再由截距計(jì)算Vmax和Km值，得到表 6。

表6 試驗(yàn)結(jié)果表Table 6 The result of experiment

游離PPO的Km值小于兩種固定化酶，說明固定化酶與底物的親和力均小于游離酶。這是因?yàn)槎喾友趸腹潭ɑ?，酶分子的空間結(jié)構(gòu)受到限制，活性部位無法完全與底物接觸。同時(shí)，載體的空間結(jié)構(gòu)造成的空間障礙和底物的擴(kuò)散限制也使酶與底物的親和力降低。比較兩種不同方法的固定化酶可知，A-PPO的Km與C-PPO相近，表明兩種固定酶與底物親和力相近。游離PPO的Vmax值遠(yuǎn)大于固定化酶，酶的固定化使其鄰域的底物濃度與游離酶也明顯不同，且固定化酶催化反應(yīng)體系中擴(kuò)散限制的存在，使得固定化酶的Vmax值均低于游離酶。同時(shí)，C-PPO的Vmax值高于A-PPO，表明包埋法固定多酚氧化酶載體上酶分子的自由度小于C-PPO，催化速率相對較低。

4 結(jié)論

采用海藻酸鈉包埋和戊二醛交聯(lián)兩種方法固定多酚氧化酶，確定其最優(yōu)固定化條件，分別為海藻酸鈉包埋法：2.5% CaCl2、2.5%海藻酸鈉、固定化時(shí)間2 h；戊二醛交聯(lián)法：1.25%戊二醛、振蕩固定pH 4.5、酶與載體質(zhì)量比75 (mg/g)、固定化反應(yīng)時(shí)間6.5 h。同時(shí)對游離多酚氧化酶和固定化多酚氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：游離酶、A-PPO和C-PPO的比活力分別為864，490，371 U/mg，A-PPO和C-PPO的酶活回收率分別為18.6%和24.0%。同時(shí)，固定化酶在pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性上優(yōu)于游離酶，戊二醛交聯(lián)法固定酶的效果優(yōu)于海藻酸鈉包埋法。戊二醛交聯(lián)法固定化酶的能力更強(qiáng)，但是比酶活要犧牲50%左右。海藻酸鈉包埋法中凝膠珠的結(jié)構(gòu)大大限制了酶與底物的接觸，同時(shí)由于凝膠珠本身的物理強(qiáng)度過低，限制了其重復(fù)利用的可能。可見，海藻酸鈉并不是酶固定化的良好載體。戊二醛作為交聯(lián)劑可以通過形成化學(xué)鍵來達(dá)到固定酶的目的，卻需要占用一定數(shù)量的活性基團(tuán)，對酶活力有一定的限制。就試驗(yàn)的兩種固定化酶方法，戊二醛是固定化酶過程中較好的交聯(lián)劑。食品及調(diào)味品行業(yè)的種類繁多，生產(chǎn)工藝及所用原材料各不相同，因此食品工業(yè)廢水成分復(fù)雜，差異性較大，導(dǎo)致酶的需求量較大，處理成本較高。酶的固定化使酶的穩(wěn)定性增加，對環(huán)境耐受性增強(qiáng)，可回收重復(fù)利用，大大降低了工業(yè)廢水處理的成本。