熊 艷，徐 俊，邱素艷, 魏益華，張金艷*

1. 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究所，江西 南昌 330200 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(南昌)，江西 南昌 330200

引 言

苯乙醇胺A屬于β-受體激動(dòng)劑，又稱為克倫巴胺，克侖巴胺，學(xué)名為2-4-(4-硝基苯基)丁基-2-羥基氨基-1-甲氧基苯乙醇，是一種人工合成的化學(xué)物質(zhì)。2010年9月四川省廣安市廣安區(qū)棗山鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站對(duì)某養(yǎng)豬場(chǎng)例行違禁藥物監(jiān)測(cè)中，用萊克多巴胺測(cè)試卡分別檢測(cè)母豬、仔豬和育肥豬尿液，發(fā)現(xiàn)該場(chǎng)育肥豬尿檢呈陽性，之后確認(rèn)是新型添加物苯乙醇胺A。同時(shí)也在破獲的瘦肉精事件中，發(fā)現(xiàn)飼料中檢測(cè)出以前從未出現(xiàn)過的苯乙醇胺A。苯乙醇胺與其他瘦肉精品種如萊克多巴胺等相比，同樣可使動(dòng)物體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)成分由脂肪向肌肉轉(zhuǎn)移，顯著提高胴體瘦肉率和飼料報(bào)酬[1-3]。但是，β-受體激動(dòng)劑易在動(dòng)物組織，特別是內(nèi)臟中蓄積殘留，其通過食物鏈進(jìn)入人體后可引發(fā)肌肉震顫、心律失常、頭痛等癥狀，嚴(yán)重者可能危及生命[4-5]。鑒于以上原因，中華人民共和國(guó)1519號(hào)公告規(guī)定，禁止在飼料和動(dòng)物飲水中使用苯乙醇胺A等物質(zhì)[6]。歐盟已于1996年禁止在畜牧生產(chǎn)中使用該類藥(ECDirective 96/22/EC)。但是，目前仍有養(yǎng)殖者將其違法使用在畜牧業(yè)中，引發(fā)藥物殘留，從而對(duì)消費(fèi)者健康造成嚴(yán)重?fù)p害。

目前的檢測(cè)分析方法有液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[7]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[8]、ELISA法[9]、免疫法[10]等。以上分析方法都分別存在樣品前處理過程復(fù)雜、需要進(jìn)行衍生化，分析時(shí)間過長(zhǎng)，涉及使用大型精密儀器設(shè)備等缺點(diǎn)，無法滿足現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)檢測(cè)需求。而膠體金試紙法存在靈敏度過低等缺陷。因此迫于開發(fā)一種無需復(fù)雜的前處理過程，無需昂貴精密的儀器設(shè)備，在普通的實(shí)驗(yàn)室就能夠開展的分析方法，鑒于該類藥物的監(jiān)測(cè)最常采集的活體樣本是尿液，基層監(jiān)督檢測(cè)中也多以尿液為樣本進(jìn)行速測(cè)篩選。因此，建立健全對(duì)此類藥物快速并行之有效的檢測(cè)方法是十分重要和必要的，這將對(duì)基層執(zhí)法監(jiān)測(cè)提供快速、準(zhǔn)確、有效的技術(shù)支撐，來滿足農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全日常監(jiān)督監(jiān)管的需要。

量子點(diǎn)作為現(xiàn)代科技的研究前沿，具有熒光產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性強(qiáng)、熒光壽命長(zhǎng)、生物相容性好、激發(fā)波長(zhǎng)范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，與生物學(xué)、免疫學(xué)等結(jié)合運(yùn)用到現(xiàn)有檢測(cè)方法中成為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)[11-13]。在目前已報(bào)道的應(yīng)用研究中，量子點(diǎn)已成功的應(yīng)用部分β-受體激動(dòng)劑的檢測(cè)分析中，如沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺，但應(yīng)用到苯乙醇胺A的檢測(cè)還并不多見?；诖耍疚囊院?jiǎn)化樣品前處理過程，在一定濃度的CdTe溶液里，苯乙醇胺A能夠使體系的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，并呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，因此建立一種檢測(cè)豬尿中的苯乙醇胺A的熒光增敏方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 設(shè)備與試劑

F-7000型熒光分光光度計(jì)(日立公司)； U3900型紫外可見分光光度計(jì)(日立公司)； pHS-3C酸度計(jì)(上海雷磁公司)； 波消解儀(美國(guó)CEM公司)。

碲粉(Te99.999%，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司)； 氯化鎘(CdCl2·2.5H2O，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)； 硼氫化鈉(96%，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)； 氫氧化鈉(分析純，中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司)； 羅丹明6G(分析純，上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司)，克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、苯乙醇胺A、特布他林、氯丙那林、妥布特羅、噴布特羅、西馬特羅、非諾特羅標(biāo)準(zhǔn)品，巰基丙酸等均購自Sigma-Aldrich公司； 實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q水處理系統(tǒng)(Millipore)制的。

1.2 方法

1.2.1 CdTe納米材料的制備

具體制備過程參見文獻(xiàn)[14]，在此基礎(chǔ)上，略作改動(dòng)，以巰基丙酸作為穩(wěn)定劑。稱取0.07 g CdCl2·2.5H2O溶于190 mL高純水中，再加入80 μL巰基丙酸，形成懸濁液體系； 用0.1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)所述懸濁液體系的pH為11，通高純氮?dú)?0 min，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入200 μL NaHTe溶液(通過Te粉與硼氫化鈉反應(yīng)所得)，控制溶液中Cd2+，HTe-，巰基丙酸的摩爾比為1.0∶1.0∶3.0，得CdTe納米材料前驅(qū)體； 將所述CdTe納米材料前驅(qū)體轉(zhuǎn)移至微波消解儀中，功率設(shè)定800 W，100 ℃加熱10 min，經(jīng)冷卻、洗滌、離心，即得所述CdTe納米材料。

1.2.2 制作熒光增敏標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制一系列不同濃度的苯乙醇胺A標(biāo)準(zhǔn)溶液，并將其分別移至5 mL的比色管中，向每個(gè)所述比色管中均加入1.0 mL濃度為7.25×10-4mol·L-1的CdTe溶液，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液定容，搖勻后，室溫放置15 min，用分子熒光光度計(jì)檢測(cè)上述各個(gè)體系的熒光強(qiáng)度F； 同時(shí)，取1.0 mL濃度為7.25×10-4mol·L-1的CdTe溶液加入到5mL的比色管中，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液定容，搖勻后室溫放置15 min，用分子熒光光度計(jì)檢測(cè)體系的熒光強(qiáng)度F0； 以苯乙醇胺A濃度為橫坐標(biāo)，以F/F0為縱坐標(biāo)，得苯乙醇胺A對(duì)CdTe納米材料熒光增敏的線性回歸方程。

1.2.3 樣品的測(cè)試

分別取1.0 mL 7.25×10-4mol·L-1的CdTe溶液和含苯乙醇胺A的樣品液加入到5 mL的比色管中，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液定容，搖勻使其充分反應(yīng)，室溫放置15 min，用分子熒光光度計(jì)檢測(cè)得到體系的熒光強(qiáng)度，與所述苯乙醇胺A對(duì)CdTe納米材料熒光增敏的線性回歸方程對(duì)照，即得所述樣品液中苯乙醇胺A的含量。

1.2.4 豬尿樣品的前處理

取豬尿樣品液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.0，過濾并將收集濾液，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 CdTe納米材料的TEM和熒光光譜圖

圖1和圖2是微波合成的CdTe納米材料的TEM圖譜和熒光光譜圖。從圖中可以看出，微波輻射法合成的CdTe納米材料大小粒徑比較均勻，粒徑約為4.5 nm，參照Demas[15]的方法來測(cè)試該量子點(diǎn)的量子產(chǎn)率達(dá)52.341%。該CdTe納米材料的最大發(fā)射波長(zhǎng)為650 nm，半峰寬為45 nm。

圖1 CdTe納米材料的TEM圖Fig.1 The TEM of CdTe nanomaterials

圖2 CdTe納米材料的熒光光譜圖Fig.2 The fluorescence spectrum of CdTe nanomaterials

2.2 CdTe納米材料與苯乙醇胺A的相互作用圖譜

圖3為不同濃度的苯乙醇胺A與CdTe納米材料的相互作用熒光圖譜。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，在CdTe納米材料體系里，當(dāng)加入8，16，32，40，60，80和120 μg·L-1不同濃度的苯乙醇胺A溶液，體系的熒光強(qiáng)度出現(xiàn)了有規(guī)律的增強(qiáng)，而且體系的最大的熒光波長(zhǎng)沒有變動(dòng)。以苯乙醇胺A濃度為橫坐標(biāo)，以F/F0為縱坐標(biāo)，得苯乙醇胺A對(duì)CdTe納米材料熒光增敏的線性回歸方程見圖4，其熒光增敏標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程F/F0=0.001 9c+ 1.032 1，線性相關(guān)系數(shù)為0.996。不同濃度的苯乙醇胺A能夠使CdTe體系的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)的可能原因是由于苯乙醇胺A能夠有效的填補(bǔ)CdTe納米材料的表面缺陷，進(jìn)而增強(qiáng)了體系的熒光強(qiáng)度。

圖3 CdTe納米材料與不同濃度苯乙醇胺A的光譜變化圖

1—8體系中苯乙醇胺A的濃度分別為0，8，16，32，40，60，80和120 μg·L-1

Fig.3 The spectrum between CdTe nanomaterials and phenylethanolamine A

The concentration of phenylethanolamine A was 0，8，16，32，40，60，80 and 120 μg·L-1respectively

圖4 苯乙醇胺A對(duì)CdTe納米材料的熒光增敏標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.4 Standard curve for fluorescence enhancement of CdTe nanomaterials by Phenylethanolamine A

2.3 影響因子

在體系優(yōu)化的過程中，固定體系內(nèi)的苯乙醇胺A的濃度為100 μg·L-1。

2.3.1 緩沖溶液的影響

實(shí)驗(yàn)考察了KH2PO4-NaOH，Tris-HCl，KH2PO4-Na2HPO4，Na2HPO4-檸檬酸4種緩沖溶液(相同的pH值，相同的濃度)對(duì)體系的ΔF的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了在KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中，體系的熒光強(qiáng)度相對(duì)穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)將其作為緩沖溶液，當(dāng)該緩沖溶液的濃度為0.06 mol·L-1時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度最大。

2.3.2 緩沖溶液pH的影響

在pH值7.2～9.8之間考察了KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液對(duì)體系ΔF的影響。結(jié)果表明當(dāng)pH值為7.4時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度ΔF最大。故本實(shí)驗(yàn)選擇pH為7.4的KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液。

2.3.3 反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、試劑加入順序的影響

實(shí)驗(yàn)選擇不同濃度的苯乙醇胺A溶液與固定濃度的CdTe溶液先混合，用磷酸鹽緩沖溶液定容，最佳的反應(yīng)時(shí)間是15 min，最佳的反應(yīng)溫度為20 ℃。

2.3.4 線性范圍、精密度、檢出限

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，體系的熒光強(qiáng)度與苯乙醇胺A在8～120 μg·L-1, 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。其回歸方程為F/F0=0.001 9c+1.032 1，線性相關(guān)系數(shù)為0.996，方法檢出限為3.5 μg·L-1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%(n=6)。

2.3.5 共存物質(zhì)的影響

2.4 機(jī)理探討

以巰基丙酸作為穩(wěn)定劑合成CdTe納米材料，表面具有很多缺陷。在一定的條件下，引入不同濃度苯乙醇胺A，耦合作用鏈接到表面具有羧基的CdTe量子點(diǎn)表面上，能夠有效地彌補(bǔ)CdTe納米材料的表面缺陷，從而使得體系的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。因此能夠基于此原理，建立一種檢測(cè)分析豬尿中的苯乙醇胺A的熒光增敏方法。

2.5 樣本的測(cè)定

利用CdTe納米材料熒光增敏法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法連用對(duì)添加的CLE的豬尿樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度檢測(cè)6次。結(jié)果見表1，該熒光增敏法能夠用于豬尿樣品中苯乙醇胺A的檢定，方法令人滿意。

表1 豬尿樣品種不同添加濃度的HPLC-MS-MS和熒光增敏法測(cè)定結(jié)果的比較

Table 1 Comparison of detection results of pork sample by HPLC-MS-MS and Fluorescence enhancing methods

添加水平/(μg·L-1)HPLC-MS-MS測(cè)定/(μg·L-1)熒光增敏法測(cè)/(μg·L-1)1010±2.310±1.22020±1.620±3.83030±3.130±4.73535±4.235±6.86060±5.260±7.98080±8.980±10.2

3 結(jié) 論

以巰基丙酸作為穩(wěn)定劑，微波輻射合成的CdTe納米材料性能優(yōu)良，粒徑均勻，約4.5 nm, 熒光強(qiáng)度強(qiáng)，量子產(chǎn)率達(dá)52.341%，半峰寬為45 nm。基于苯乙醇胺A在一定的條件下，能夠填充CdTe納米材料的表面缺陷，使得體系的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，從而建立一種檢測(cè)苯乙醇胺A的熒光增敏方法。苯乙醇胺A在8～120 μg·L-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。其回歸方程為F/F0=0.001 9c+1.032 1，線性相關(guān)系數(shù)為0.996，方法檢出限為3.5 μg·L-1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%(n=6)，經(jīng)與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相比，結(jié)果滿意。為苯乙醇胺A的檢測(cè)提供一種分析方法。