康 瑜, 楊小芳

(四川省遂寧市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 遂寧 629000)

槲皮素(quercetin)是酪氨酸激酶特異性抑制劑，在綠色植物中廣泛存在，屬于黃酮類化合物。近年來研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有清除自由基、抗氧化、抗病毒、抗炎性反應、抗腫瘤等廣泛的生物學功能[1-3]。槲皮素對心血管疾病也有較好的治療效果[4]，并具有抗心肌缺血再灌注損傷的作用[5]。然而槲皮素普通制劑具有難溶于水、靶向性差等特點，限制了其在疾病治療中的應用。而以納米脂質(zhì)體為藥物載體包裹槲皮素制成納米脂質(zhì)體槲皮素(nanoliposomal quercetin, nLQ)，可以提高槲皮素的生物利用度、靶向性，提高療效，降低不良反應[6,7]。本研究以槲皮素為原料，采用薄膜蒸發(fā)-高壓均質(zhì)法制備nLQ，然后通過腹腔注射作用于局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠模型，觀察nLQ 對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用，并對其機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級50 d 齡雄性 SD 大鼠, 體質(zhì)量260～300 g,由四川中醫(yī)藥科學院實驗動物中心提供[SCXK(川)2008-19]，飼養(yǎng)于成都達碩生物科技有限公司實驗室[SYXK(川)2019-189]。

1.2 主要試劑及儀器

槲皮素購自成都超人植化公司(HPLC含量≥98%，產(chǎn)品規(guī)格20 mg/支，生產(chǎn)批號: 050602);膽固醇購自北京化學試劑公司；磷脂購自德國Lipoid 公司; 紅四氮唑(TTC)購自上海鈺博生物科技有限公司; TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Roche 公司; 組織總蛋白提取試劑盒、二辛可寧酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司; 兔抗鼠B 淋巴細胞瘤-2 基因(Bcl-2)、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白(Bax)及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體購自美國CST公司; 辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG購自英國Abcam公司; 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素10(IL-10) ELISA 試劑盒購自晶美生物工程有限公司。AUW120D 型電子分析天平購自日本島津公司; 探針式超聲儀購自美國Branson 公司; 蛋白化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)FluorChem E 購自美國Protein Simple公司; Multiskan MK3 型酶標儀購自芬蘭 Thermo Labsystems 公司;顯微鏡購自美國Thermo 公司。

1.3 nLQ 的制備

采用薄膜蒸發(fā)-高壓均質(zhì)法[8]制備。按處方量準確稱量槲皮素、膽固醇、卵磷脂、腦磷脂和聚乙二醇-4000，以質(zhì)量比6∶4∶9∶5∶1 混勻，用氯仿和二甲基亞砜(DMSO)(體積比3∶1)完全溶解。將混勻后的溶液倒入燒瓶中，37 ℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)4～8 h。PBS 水化后，置于超聲破碎儀中反復破碎，待脂質(zhì)體槲皮素可通過80 nm濾膜后，即獲得nLQ。

1.4 實驗分組

80 只大鼠隨機分為5 組，每組16 只: 假手術(shù)組，模型組，nLQ 低、中、高劑量組。nLQ 質(zhì)量濃度均為5 mg/mL，采用腹腔注射給藥。低、中、高劑量組給藥量分別為5 mg/kg、7.5 mg/kg和10 mg/kg, 在造模前7 d及術(shù)前1 h分別腹腔注射給藥。假手術(shù)組及模型組注射等體積生理鹽水。

1.5 大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型制備

參照Longa 等[9]改良線栓法制備大鼠中動脈栓塞模型: 用7%水合氯醛按5 mL/kg 的劑量腹腔注射麻醉大鼠, 仰臥固定于手術(shù)臺上, 75%乙醇溶液消毒頸部皮膚, 頸部正中縱行切開皮膚, 分離左側(cè)頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)。在ICA 和ECA 分叉處用手術(shù)線結(jié)扎ECA主干, 用動脈夾暫時阻斷CCA和ICA 近心端血流,遠心端用一手術(shù)線輕輕拉起, 在ECA結(jié)扎點近端用1 mL注射器針頭刺一小口，將一段頭端燒圓的尼龍線插入ICA，至大腦中動脈起始部以完全阻斷供血，插入深度約為18 mm, 可感到阻力, 扎緊頸內(nèi)動脈的手術(shù)線，縫合傷口阻斷左側(cè)大腦中動脈血流。阻斷2 h 后，抽出栓線，進行再灌注。假手術(shù)組除不導入線栓，其余操作均同模型組。

1.6 神經(jīng)功能缺損評分

大鼠在腦缺血 2 h 再灌注 48 h 后，按照5 分制評分標準，對大鼠神經(jīng)功能缺失癥狀進行分級評分：可以自由活動，無明顯神經(jīng)功能損傷癥狀，記為0 分；病灶對側(cè)前爪不能完全伸直，記為1 分；行走時向病灶對側(cè)不自主旋轉(zhuǎn)，記為2分；向病灶對側(cè)傾倒，記為3 分；意識喪失，不能自發(fā)活動，記為4 分。評分越高，說明神經(jīng)功能缺損越嚴重。

1.7 腦梗塞體積及腦含水量測定

大鼠腦缺血再灌注48 h 后，每組隨機選取6 只，用10%水合氯醛麻醉后快速處死取腦，去除小腦、嗅腦及低位腦干，用電子分析天平準確稱量腦組織濕重。置于-20 ℃冰箱中冷凍30 min后，將腦組織以2 mm 間距做冠狀切片，并立即浸泡在2% TTC 磷酸緩沖液中，37 ℃避光孵育30 min，以質(zhì)量分數(shù)4%的多聚甲醛溶液固定24 h。正常腦組織經(jīng)染色后為紅色，腦梗死組織經(jīng)染色后為白色，腦切片經(jīng)拍照采集圖像后用Image J 1.37 圖像分析軟件測量紅、白區(qū)域體積，計算梗死體積百分比。腦梗死體積百分比=(腦梗死體積/總腦片體積)×100%。

將染色后的腦組織置于120 ℃烤箱中烘干至恒重，記錄干重。結(jié)合稱量的大腦濕重，計算腦組織含水率。腦含水率=(1-腦組織干重/腦組織濕重)×100%。

1.8 ELISA 測定血清TNF-α 和IL-10 含量

大鼠腦缺血再灌注48 h 后，每組選取6 只。用7%水合氯醛麻醉后打開胸腔，用5 mL注射器抽取心臟血2 mL，待常溫凝固后，2500 r/min離心15 min。抽取上清液, 采用ELISA 法測定血清中TNF-α和IL-10 含量，按照試劑盒說明書操作步驟進行。用酶標儀測定450 nm 處的吸光度(A)值，通過繪制標準曲線求出樣品中TNF-α和IL-10 含量。

1.9 流式細胞術(shù)檢測腦組織神經(jīng)細胞凋亡情況

將腦缺血再灌注48 h 后的大鼠用7%水合氯醛麻醉，抽血后分離缺血側(cè)腦組織，用PBS 漂洗去除血細胞，手術(shù)剪剪碎后加入1.25 g/L 的胰蛋白酶溶液，于37 ℃消化30 min 左右，然后用200 目細胞篩過濾，濾液經(jīng)1500 r/min 離心10 min，細胞沉淀用PBS沖洗2次制成單細胞懸液(細胞密度為1×106個/mL)。取1 mL 細胞懸液離心并收集沉淀，PBS 清洗2 次后，加入500 μL 結(jié)合緩沖液重懸細胞，然后加入10 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL碘化丙錠(PI)混勻，室溫避光孵育15 min,用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.10 Bcl-2 和Bax 蛋白表達水平檢測

取大鼠再灌注損傷48 h后的腦組織，剪碎后放置于研缽中，加入液氮充分研磨。按照蛋白提取試劑盒說明書提取組織總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。取蛋白樣品與Loading buffer 充分混合后，100 ℃煮沸5 min 變性。將變性蛋白樣品以每孔50 μL 的量加入到SDS-PAGE 凝膠上樣孔中，80 V 電壓電泳30 min 后，調(diào)整電壓為120 V 至電泳結(jié)束。按照常規(guī)方法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，轉(zhuǎn)膜電壓為90 V。取出PVDF 膜，經(jīng)5%脫脂奶粉溶液封閉2 h 后，依次與兔抗鼠Bcl-2、Bax 和GAPDH 單克隆抗體(500 倍稀釋)4 ℃孵育過夜，然后與辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG(1 000 倍稀釋)室溫孵育1 h，PBST 洗滌3 次后，滴加電化學發(fā)光(ECL)顯色液，顯影，定影，曝光。用蛋白化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析蛋白表達水平。

1.11 統(tǒng)計學分析

所有實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析均在SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件上進行，結(jié)果以x-± s 表示，多組比較用單因素方差分析，兩組比較用t 檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學評分

如表1 所示，模型組大鼠表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀，術(shù)后行為學評分顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)，說明造模成功；與模型組比較，nLQ 低劑量組大鼠行為學評分明顯降低(P<0.05)，nLQ 中劑量組和nLQ 高劑量組大鼠行為學評分顯著降低(P<0.01)。結(jié)果說明nLQ 能夠顯著改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能缺損狀況，且作用劑量越高，對神經(jīng)功能的改善效果越好，具有劑量-效應關(guān)系。

表1 大鼠腦缺血再灌注后行為學評分Table 1 The behavioral score of rats after cerebral ischemia reperfusion

2.2 大鼠腦梗死體積與腦含水量

如圖1 所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦梗死體積比與腦含水率均顯著升高(P<0.01)。與模型組相比， nLQ 低、中、高劑量組大鼠腦梗死體積比均顯著降低(P<0.01)，腦含水率均明顯降低(P<0.05)，且具有劑量-效應關(guān)系。

2.3 血清中TNF-α 和 IL-10 含量

如圖2 所示, 與假手術(shù)組相比, 模型組大鼠血清中TNF-α和 IL-10 的含量均顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，nLQ 低、中、高劑量組大鼠血清中TNF-α和 IL-10 的含量均顯著降低(P<0.01)，且具有劑量-效應關(guān)系。

2.4 腦組織神經(jīng)細胞凋亡情況

大鼠腦缺血再灌注48 h 后, 用流式細胞術(shù)檢測腦組織神經(jīng)細胞凋亡情況, 并用Western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達情況。結(jié)果如圖3 所示, 與假手術(shù)組相比, 模型組大鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，Bcl-2 蛋白表達水平顯著降低(P<0.01), Bax 蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)。與模型組相比, nLQ 低、中、高劑量組大鼠腦組織細胞凋亡率均顯著降低(P<0.01); nLQ低劑量組Bcl-2 蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，Bax 蛋白表達水平明顯降低(P<0.05); nLQ 中、高劑量組Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.01), Bax蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)。

圖1 大鼠腦缺血再灌注后腦梗死體積與腦含水量測定結(jié)果Figure 1 Cerebral infarct volume and brain water content after cerebral ischemia reperfusion in rats

圖2 大鼠血清中TNF-α和 IL-10 含量檢測結(jié)果Figure 2 TNF- α and IL-10 content detected in serum of rats

圖3 大鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡及Bcl-2 和Bax 蛋白表達情況Figure 3 Neuron apoptosis and the expressions of Bcl-2 and Bax proteins in brain tissues of rats

3 討論

在中國，腦血管疾病居三大死因之首，其中缺血性腦血管病占60%～80%，致死致殘率高，嚴重威脅人類健康。對缺血性腦血管病，目前強調(diào)早期溶栓治療, 以實現(xiàn)血管再通[10], 但由此也會導致缺血再灌注損傷的發(fā)生, 加重組織、器官的結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙，進而導致患者病情加重[11]。所以，如何保護腦組織和神經(jīng)細胞免受損傷，抑制缺血梗死區(qū)擴大，以及促進神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能恢復等，是研究的熱點。

槲皮素具有清除體內(nèi)自由基、抗氧化、抗病毒、抗炎性反應和抗腫瘤等廣泛的生物學功能。有研究報道，槲皮素對心肌損傷及腦損傷的保護作用與其抗氧化能力相關(guān)[12-13]。并且槲皮素在肝臟疾病治療中的應用比較多，體內(nèi)氧自由基堆積是造成肝臟損傷的主要原因，研究顯示，槲皮素能夠通過抗氧化及清除氧自由基對肝損傷產(chǎn)生保護作用[14]。相關(guān)研究也表明，槲皮素安全、無毒副作用[15]。但槲皮素難溶于水，極大地限制了其在體內(nèi)的吸收。而脂質(zhì)體是一種新型的藥物載體，用其包裹藥物能夠增加增加藥物的水溶性及在體內(nèi)的循環(huán)時間。因此，本實驗采用脂質(zhì)體作為載體包裹槲皮素，并將粒徑控制在80 nm 以內(nèi)，制備nLQ。然后用線栓法構(gòu)建大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，通過腹腔注射不同劑量的nLQ，觀察其對腦損傷的保護作用。結(jié)果顯示，nLQ 能夠顯著改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能, 降低腦梗塞體積和腦水腫程度, 且具有劑量-效應關(guān)系。說明nLQ 對大鼠腦缺血再灌注損傷具有良好的神經(jīng)保護作用。

腦缺血再灌注損傷是多種因素參與的復雜反應，在損傷組織周圍也存在著繼發(fā)性損傷[16]。研究顯示，在腦缺血再灌注過程中，炎性反應細胞因子的過量表達起著重要的作用[17-18]。在腦缺血早期階段，TNF-α分泌增多是腦梗死形成的主要原因，腦缺血再灌注過程中，TNF-α過度表達會導致腦梗死范圍擴大，神經(jīng)功能損傷加重，缺血腦組織血流量減少，進一步加重血腦屏障的損害[19]。因此阻斷TNF-α表達可減少缺血性神經(jīng)元損傷。IL-10 主要由Th2 細胞產(chǎn)生，是很強的抗炎性反應細胞因子，能夠抑制促炎性反應細胞因子的過度表達，維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[20]。在腦缺血再灌注損傷過程中，IL-10 可下調(diào)炎性反應細胞因子的表達，抑制炎性級聯(lián)反應的發(fā)生，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[21]。因此，檢測血清或腦組織中TNF-α和IL-10含量對衡量腦損傷程度具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中TNF-α和IL-10 含量均顯著高于假手術(shù)組，nLQ 低、中、高劑量組大鼠血清中TNF-α和IL-10 含量均顯著低于模型組，且具有劑量-效應關(guān)系。以上結(jié)果提示nLQ 對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用可能與其能夠降低炎性反應相關(guān)。

腦組織神經(jīng)元細胞凋亡也是造成腦缺血再灌注損傷的重要機制之一[22]，本研究用流式細胞術(shù)檢測了大鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡情況，結(jié)果顯示nLQ 能夠降低腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織的神經(jīng)細胞凋亡率，并呈濃度依賴性。細胞凋亡是受多種因素調(diào)節(jié)的細胞程序性死亡過程。Bcl-2蛋白家族是目前已知的細胞凋亡中最重要的調(diào)控因子之一，根據(jù)作用不同，分為促凋亡基因和抑凋亡基因兩類，其中Bcl-2 可抑制細胞凋亡，Bax 可促進細胞凋亡[23]。研究顯示，Bcl-2 和Bax 表達變化與腦缺血再灌注損傷引起的神經(jīng)細胞凋亡增多相關(guān)[24]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，nLQ 低、中、高劑量組大鼠腦組織中Bcl-2 蛋白表達水平明顯升高，Bax 蛋白表達水平明顯降低。提示nLQ 對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用可能與其能夠調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達，進而有效抑制腦組織神經(jīng)細胞凋亡相關(guān)。

綜上所述，nLQ 對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有很好的保護作用，其機制可能與nLQ 能夠改善神經(jīng)功能缺損癥狀，減少神經(jīng)細胞凋亡及降低血中炎性反應因子TNF-α和 IL-10 的含量有關(guān)。本實驗結(jié)果為腦缺血再灌注損傷的有效預防及治療提供了新的思路。