楊仔威，廖 敏，楊金通，張 全，龔安龍，字成庭,2

(1 云南農業(yè)大學理學院，云南 昆明 650201；2 云南農業(yè)大學普洱茶學教育部重點實驗室，云南 昆明 650201)

兒茶素是茶葉中的重要活性成分，具有抗腫瘤、抗心血管疾病和延緩衰老等多種生理功能。兒茶素主要包括：表兒茶素(Epieatechin(EC, 1))、表兒茶素沒食子酸酯(Epieatechingallate(ECG, 2))、表沒食子兒茶素(Epigalloeateehin(EGC, 3))和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigalloeateehingallate(EGCG, 4))等[1-2]。其化學結構式如圖1所示。大量研究表明，兒茶素具有抗氧化、抗癌、抗突變、抗菌和保護神經系統(tǒng)等功效[3-5]。但是，兒茶素類化合物在水相或油相中溶解度不高；光照、潮濕環(huán)境下易發(fā)生氧化、聚合和縮合等反應。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)在一定的條件下轉變?yōu)镃3位的空間異構體沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)。GCG和EGCG均被認為是茶葉中自由基清除活性較強的兒茶素成分，最近研究表明高濃度時GCG和EGCG具有相同的自由基清除能力，低濃度時，GCG的自由基清除能力強于EGCG，濃度越低，差異越明顯[6]。由此可見，對于GCG具有一定研究價值，EGCG成分能在高溫狀態(tài)下能合成發(fā)生異構化作用形成氧化產物GCG，但是這種轉化異構化作用不僅與溫度、反應時間有關，還與pH值有關。本文探究的是EGCG氧化成為GCG最佳反應條件。

圖1 兒茶素的化學結構式

1 實 驗

1.1 材料與主要試劑

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG，純度>98%)，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；甲醇(德國，MERCK，色譜純)；冰乙酸(AT級)；超純水；三氟乙酸；濃鹽酸；Na2CO3(AR)。

1.2 主要儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，安捷倫；理化檢測型超純水機，普力菲爾；磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限公司；電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；旋轉蒸發(fā)儀，Heidolph。

1.3 HPLC分析條件

將20 mg EGCG粉末溶于相對應的10 mL不同的pH溶液中進行反應，當達到反應終點時，利用乙酸乙酯進行萃取2～3次，在旋轉蒸發(fā)儀將其減壓蒸干，將其溶于1 mL分析甲醇中，進行HPLC分析檢測。Agilent 1260進行分析；Agilent ZOR-BAX SB-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm × 250 mm)，流動相：A相為超純水(含0.05%三氟乙酸)，B相為分析甲醇，A相85%，柱溫37 ℃，檢測波長為280 nm，30 min內完成檢測,每次檢測后都須將系統(tǒng)平衡15 min才能進行下一次進樣。

2 結果與討論

2.1 EGCG氧化產物HPLC分析

通過HPLP分析EGCG氧化產物，存在一個主要的成分，其產率隨著氧化條件的改變而不同，但是其氧化產物出峰時間基本保持在(tR= 24.843 min)附近，在相同的條件下將不同的兒茶素單體與EGCG氧化產物進行分析：EGCG氧化物(S1)，EC(S5)，ECG(S4)，EGC(S3)、EGCG(S2)和GCG(S6)，結果顯示，EGCG氧化物為GCG，如圖2所示。

圖2 兒茶素類化合物的液相色譜圖

2.2 不同條件下EGCG氧化產物分析

2.2.1 不同pH條件對EGCG氧化產物的影響

pH值(3～10)對EGCG氧化產率的影響，如圖3所示，在反應溫度為25 ℃，反應時間為0.5 h時，不同的pH條件下，EGCG氧化產物的峰面積不同。當pH=5時，EGCG氧化產物的峰面積為90.674%。因此，EGCG的氧化pH值應該保持在5時，氧化物的產率最佳。

圖3 反應pH值對EGCG氧化物峰面積的影響

2.2.2 不同反應溫度對EGCG氧化產物的影響

在不同的反應溫度下(25～85 ℃)，EGCG氧化產物的產率不同，如圖4所示，在反應的pH為5，反應時間為0.5 h的條件下，不同的反應溫度對EGCG氧化的影響，隨著反應溫度的升高，所得到的EGCG氧化物的產率逐漸減少。因此，最佳的反應時間是0.5 h。

圖4 反應溫度對EGCG氧化物峰面積的影響

2.2.3 不同反應時間對EGCG氧化產物的影響

在不同的反應時間下(0.5～12 h)，EGCG氧化產物的產率不同，如圖5所示，

隨時反應時間的增加，EGCG氧化物的產率不斷減少。當反應的時間為0.5 h時產率為最大值(73.188%)。

圖5 反應時間對EGCG氧化物峰面積的影響

通過上述對不同pH值(3～10)、不同溫度(25～85 ℃)和反應時間(0.5～12 h)對EGCG氧化產率的影響，以三個因素與最終響應值(峰面積、峰面積占比)之間的關系，最終優(yōu)化得到EGCG氧化成為GCG的條件：在pH值5，氧化時間0.5 h，溫度25 ℃時GCG產率達到最大值，而純度可達98.5%。

3 結 論

該實驗中通過氧化EGCG并分析氧化物的組成，得出EGCG氧化成為GCG的最佳條件為pH值5、溫度25 ℃、氧化時間0.5 h，在此實驗條件下，得到的EGCG氧化物GCG達到產量最大值，得到GCG的純度達98.5%。