呂和力

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是大腦中最常見的原發(fā)性腫瘤，占所有惡性腦腫瘤的80%[1]?；熓悄z質(zhì)瘤重要的輔助治療手段之一，但是由于腫瘤存在異質(zhì)性的問題，病人對化療藥物的敏感性有很大差異，從而影響了治療效果。順鉑是膠質(zhì)瘤化療的重要藥物之一，因此探討膠質(zhì)瘤的順鉑耐藥分子特征，對開發(fā)膠質(zhì)瘤個體化化療具有參考意義。泛素特異性肽酶22 (ubiquitin specific peptidase 22，USP22)是泛素水解酶家族一個較新的成員，被證實(shí)在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色[2-3]。大量的研究發(fā)現(xiàn)USP22在多種腫瘤中表達(dá)增高，其異常高表達(dá)常預(yù)示腫瘤即出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或出現(xiàn)化療耐藥[4-5]。其中，李朝暉等[6]檢測到USP22基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并且證實(shí)USP22基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖中發(fā)揮重要作用。王宛明等[7]發(fā)現(xiàn)抑制USP22表達(dá)可增加胰腺癌細(xì)胞對化療藥物吉西他濱的敏感性。但是，USP22 是否與膠質(zhì)瘤耐藥相關(guān)尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究探討在膠質(zhì)瘤中USP22的表達(dá)是否參與其順鉑耐藥，從而發(fā)掘膠質(zhì)瘤順鉑耐藥的潛在分子機(jī)制，為膠質(zhì)瘤化療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251購自中科院上海細(xì)胞所。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司。順鉑(cisplatin)購自美國Sigma公司。USP22單克隆抗體為美國Santa Cruz公司的產(chǎn)品。Lipofectamine 2000試劑、CCK-8試劑盒和Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 誘導(dǎo)順鉑耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞株 參照文獻(xiàn)[8]，用順鉑劑量梯度爬升篩選方法將U251細(xì)胞體外培養(yǎng)10個月，建立順鉑耐受細(xì)胞株(U251/CP2)。采用CCK-8方法，測定細(xì)胞的順鉑半數(shù)抑制濃度(IC50)，鑒定所誘導(dǎo)的U251/CP2細(xì)胞株的耐藥性。

1.2.2 構(gòu)建USP22沉默表達(dá)的細(xì)胞株 利用Lipofectamine 2000將USP22-shRNA表達(dá)質(zhì)粒與病毒包裝混合質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，進(jìn)行病毒包裝。收集病毒液后分別感染U251和U251/CP2細(xì)胞，polybrene篩選穩(wěn)定干擾USP22表達(dá)的細(xì)胞克隆。RT-PCR法檢測細(xì)胞USP22 mRNA表達(dá)水平，鑒定沉默效果。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染24 h后，收集細(xì)胞。PBS洗滌2次，重懸于500 μL的Binding Buffer溶液中，細(xì)胞篩過篩，加入5 μL Annexin Ⅴ和 5 μL PI染色液后混勻，室溫下孵育15 min，然后上樣至流式細(xì)胞儀檢測分析凋亡情況。

1.2.4 Western blotting檢測USP22蛋白水平 提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，BCA法檢測蛋白濃度后取等量蛋白上樣，10% SDS-PAG/E恒壓電泳分離蛋白，然后恒流電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，USP22一抗和GAPDH內(nèi)參4 ℃孵育過夜，PBST洗膜后，二抗37 ℃孵育1 h，采用凝膠成像系統(tǒng)成像，利用圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 CCK-8檢測順鉑IC50取對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后制備成細(xì)胞懸液，以2×104/mL密度接種于96孔板，每孔100 μL，貼壁過夜。不同分組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育3 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度，繪制曲線，計(jì)算順鉑IC50。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析及q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 順鉑耐藥細(xì)胞株U251/CP2的建立 經(jīng)歷持續(xù)10個月的誘導(dǎo)，獲得在順鉑(2 μg/mL)中生長良好的耐藥細(xì)胞U251/CP2。與親本細(xì)胞相比，U251/CP2形態(tài)略有變化，表現(xiàn)為胞體較小，軸突較短且未分叉(見圖1)。CCK-8法檢測親本細(xì)胞U251和耐藥細(xì)胞U251/CP2對順鉑的敏感性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，顯示U251/CP2順鉑耐藥；U251/CP2細(xì)胞無藥培養(yǎng)2周后，IC50為(71.68±0.49) μg/mL，耐藥性未見降低(P>0.05)，說明U251/CP2對順鉑穩(wěn)定耐藥(見表1)。

表1 耐藥細(xì)胞U251/CP2的耐藥性檢測

q檢驗(yàn)：與對照組U251比較**P<0.01

2.2 USP22沉默細(xì)胞株U251-shUSP22、U251/CP2-shUSP22的建立 RT-PCR檢測U251組、U251/CP2組、U251-shUSP22組和U251/CP2-shUSP22組細(xì)胞中USP22 mRNA的相對表達(dá)量分別為0.80±0.10、0.29±0.02、0.12±0.05、0.18±0.05。與U251組相比，U251-shUSP22組的USP22 mRNA表達(dá)水平明顯降低(t=10.49,P<0.01)；與U251/CP2組相比，U251/CP2-shUSP22組的USP22 mRNA表達(dá)水平也明顯降低(t=3.44,P<0.05)，說明成功干擾USP22基因沉默表達(dá)(見圖2)。

2.3 抑制USP22表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞儀檢測U251組、U251-shUSP22組、U251/CP2組和U251/CP2-shUSP22組的細(xì)胞凋亡率分別為(4.13±0.59)%、(23.64±4.82)%、(7.65±0.73)% 和(19.36±5.49)%；與U251組相比，U251-shUSP22組細(xì)胞凋亡率明顯升高(t=6.96，P<0.01)；與U251/CP2組相比，U251/CP2-shUSP22組的細(xì)胞凋亡率同樣也明顯升高(t=3.66，P<0.05)；提示抑制USP22的表達(dá)可以顯著提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡率(見圖3)。

2.4 順鉑促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中USP22蛋白的表達(dá) Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)0 μg/mL、0.5 μg/mL、8 μg/mL順鉑短暫處理(24 h)后U251細(xì)胞內(nèi)USP22蛋白相對表達(dá)量分別為0.21±0.02、0.30±0.01、0.64±0.01，U251/CP2細(xì)胞2 μg/mL順鉑短暫處理(24 h)后USP22蛋白相對表達(dá)量為0.43±0.02(見圖4)。與對照U251(0 μg/mL)組相比，USP22蛋白表達(dá)水平在U251(0.5 μg/mL)組、U251(8 μg/mL)組和U251/CP2(2 μg/mL)組中均明顯提高(t=9.70、40.35、14.60,P<0.01)。提示順鉑用藥可影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞中USP22的表達(dá)。

2.5 USP22表達(dá)下調(diào)增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性 與對照細(xì)胞U251相比，U251-shUSP22中USP22的蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(t=6.83，P<0.01)(見圖5)。同時，U251-shUSP22的順鉑IC50為(0.56±0.07) μg/mL，與U251的順鉑IC50 (1.23±0.13) μg/mL差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.70，P<0.01)。提示下調(diào)USP22表達(dá)可增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性。

2.6 USP22表達(dá)下調(diào)可部分逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞株對順鉑耐藥 與對照細(xì)胞U251/CP2相比，U251/CP2-shUSP22中USP22蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(t=3.01，P<0.05)(見圖6)。U251/CP2的順鉑IC50為(73.73±2.74) μg/mL，而U251/CP2-shUSP22的順鉑IC50下降至(51.25±1.09) μg/mL(P<0.01) (見表2)，提示USP22表達(dá)下調(diào)，可逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞株U251/CP2對順鉑的耐藥。U251與U251/CP2-shUSP22的順鉑敏感性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明USP22表達(dá)下調(diào)可在一定程度上逆轉(zhuǎn)U251/CP2對順鉑耐藥，但并非完全逆轉(zhuǎn)。

表2 CCK-8檢測各組細(xì)胞的順鉑

q檢驗(yàn)：與對照組U251比較**P<0.01

3 討論

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，惡性程度高，侵襲性強(qiáng)，易復(fù)發(fā)，治療相當(dāng)困難。目前臨床常用的治療膠質(zhì)瘤推薦方案包括替莫唑胺(TMZ) 劑量密度方案、聯(lián)合治療方案、抗血管生成治療等。替莫唑胺為常用抗腫瘤藥物，可通過阻斷DNA合成，發(fā)揮抗腫瘤作用，控制病情進(jìn)展。但是，并非所有病人均對替莫唑胺敏感，比如，O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶高表達(dá)病人易對烷化劑類產(chǎn)生耐藥性[9]。有學(xué)者[10]指出采用替莫唑胺與鉑類藥物聯(lián)合治療復(fù)發(fā)性惡性腫瘤效果更優(yōu)，可有效改善病人臨床癥狀，控制癌灶擴(kuò)散，延長病人生存時間。

順鉑是臨床上最常用的鉑類藥物，主要作用靶點(diǎn)就是DNA，通過在細(xì)胞內(nèi)形成鉑-DNA加合物抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，是臨床治療多種實(shí)體瘤的重要藥物，也是對膠質(zhì)瘤敏感性較高的藥物之一[11-12]。以抑制DNA合成的抗腫瘤藥物，同時會使細(xì)胞啟動防止其自身凋亡的多種修復(fù)機(jī)制來修復(fù)損傷的DNA，比如激活各種DNA修復(fù)酶使受損傷的DNA盡量恢復(fù)其結(jié)構(gòu)和功能，從而盡量維持其正常的結(jié)構(gòu)和功能，從而降低了該藥物的臨床療效，使得腫瘤對該藥物產(chǎn)生耐藥性[13]。

膠質(zhì)瘤的化療耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，涉及到多方面因素，比如腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物的積聚減少、藥物作用靶點(diǎn)減少、凋亡與抗凋亡機(jī)制失衡、DNA修復(fù)機(jī)制及腫瘤干細(xì)胞等。TABATABAI等[14]從膠質(zhì)瘤中分離出膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cell,GSC)并發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和GSC均具有多藥耐藥現(xiàn)象，以GSC更為顯著。無論在體內(nèi)還是體外GSC基本處于休眠狀態(tài)，停滯于細(xì)胞周期中的G0/G1期并且高表達(dá)ABCG2、MDR等耐藥基因。GSC能特征性表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體，能將多種化療藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外，從而對化療藥物產(chǎn)生耐藥性[15]。另外，膠質(zhì)瘤的耐藥性還可能與高表達(dá)的MGMT、抗凋亡蛋白和凋亡蛋白抑制因子有關(guān)。崔磊等[16]利用芯片-基因組雜交技術(shù)篩選膠質(zhì)瘤細(xì)胞中與順鉑耐藥相關(guān)分子標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)與膠質(zhì)瘤順鉑耐藥有關(guān)的基因包括CFHR1、CFHR3和IL-7等。但是，USP22基因是否也參與了膠質(zhì)瘤耐藥尚未有研究報(bào)道。

USP22基因位于人類17號染色體，編碼蛋白產(chǎn)物約66 000，是hSAGA(human Spt-Ada-Gcn5 acetyltransferase)復(fù)合物的一個亞單位,是一類去泛素化酶，主要通過去泛素化修飾來調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長分化、影響細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄激活和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。同時，USP22作為一個腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記家族的成員，在細(xì)胞周期、DNA轉(zhuǎn)錄、腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，USP22可能通過細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換參與腫瘤耐藥[17]。

李朝暉研究團(tuán)隊(duì)[6,18]通過多項(xiàng)研究，明確了USP22在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)，且驗(yàn)證了USP22通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖中發(fā)揮作用。呂磊等[19]的研究指出沉默USP22可逆轉(zhuǎn)膀胱癌細(xì)胞T24對絲裂霉素化療藥的耐藥。王宛明等[7]的研究則指出了抑制USP22可逆轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞SW1990對吉西他濱化療藥的耐藥。然而，關(guān)于USP22是否參與了膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐藥目前尚無人研究。

本研究首次探討USP22表達(dá)與膠質(zhì)瘤細(xì)胞順鉑耐藥的關(guān)系。首先，通過劑量梯度爬升誘導(dǎo)順鉑耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251/CP2，相對于親本細(xì)胞株U251，U251/CP2對順鉑的敏感性顯著下降，顯示出順鉑耐受。此后，Western blotting檢測其中USP22蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在U251/CP2中USP22的表達(dá)顯著高于U251，提示USP22可能參與了膠質(zhì)瘤順鉑獲得性耐藥。因此，本文又采用小干擾RNA沉默U251、U251/CP2細(xì)胞的USP22表達(dá)，證實(shí)抑制USP22表達(dá)可降低U251對順鉑的抗藥性并可在一定程度上逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞株對順鉑的耐藥。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)USP22的表達(dá)與膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞對順鉑的耐藥有相關(guān)性，提示USP22可能是膠質(zhì)瘤順鉑耐藥的分子機(jī)制之一，為進(jìn)一步研究膠質(zhì)瘤順鉑耐藥機(jī)制提供了新的方向。