孫 紅，宋珊珊，井 汶，張 優(yōu)，谷 雨，居文政

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京210029）

抑郁癥具有高發(fā)病、高自殺、高復(fù)發(fā)和低識(shí)別、低就診、低治療等特點(diǎn)，已成為21 世紀(jì)最主要的精神疾病，據(jù)WHO 統(tǒng)計(jì)，全球抑郁癥患者達(dá)12.8%，預(yù)計(jì)2030 年將成為僅次于心血管疾病的第二大疾?。?-2］，我國患病率高達(dá)6.1%［3］。目前，抗抑郁西藥以單胺類抑制劑為主［4］，但這些藥物起效慢，不良反應(yīng)明顯，而且30%～50%的患者不敏感。近年來，中醫(yī)藥在防治抑郁癥上獲得較好的臨床療效。

四神丸出自 《證治準(zhǔn)繩》，由肉豆蔻、補(bǔ)骨脂、五味子、吳茱萸、大棗等藥材組成［5］，具有溫補(bǔ)脾腎的功能，組方加減后用于治療脾腎陽虛患者有一定療效［6］。原發(fā)性抑郁、內(nèi)源性抑郁、惡劣心境中的抑郁情緒在本質(zhì)上“屬虛”，五臟陽氣不足是其病理基礎(chǔ)［7］，根據(jù)中醫(yī)郁證病機(jī)中“陽虛致郁” 的理論［8-9］，四神丸可改善脾腎陽虛所致的抑郁狀態(tài)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明［10-14］，方中補(bǔ)骨脂和五味子中主要成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、五味子醇甲具有抗抑郁作用，但作用機(jī)理尚不明確，雖然已有方中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素在正常大鼠中的藥動(dòng)學(xué)研究［15］，但尚未見在抑郁大鼠中的相關(guān)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)將比較四神丸中上述3 種成分在正常大鼠和抑郁大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)，探索其作用機(jī)理。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀，配置API 4000 LC-MS／MS 三重四級桿質(zhì)譜儀 （美國Agilent 公 司）；MS105 電子天 平 （瑞 士Mettler-Toledo 公司）；Centrifuge-5417R 冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；Advantage A10 超純水機(jī)（法國Millipore 公司）；MIX-25P 旋渦混合儀（杭州米歐儀器有限公司）；Labconco 離心濃縮儀 （美國Labconco 公司）；RE-52CS 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試劑與藥物 肉豆蔻（煨） （批號(hào)171001）、補(bǔ)骨脂（鹽炒） （批號(hào)180404006）、五味子（醋制） （批號(hào)170513001）、吳茱萸（制） （批號(hào)160623）、大棗（去核） （批號(hào)170520001） 均購于北京同仁堂南京藥店，經(jīng)江蘇省中醫(yī)院藥學(xué)部副主任中藥師張倩鑒定為正品，符合《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。對照品補(bǔ)骨脂素（批號(hào)17092820）、異補(bǔ)骨脂素 （批 號(hào)18062910）、五味子醇甲 （批 號(hào)17021905） 均購于成都曼思特生物科技有限公司，純度均≥98.5%；替硝唑 （批號(hào)100126-200402）購于中國食品藥品檢定研究院，純度≥95%。四神丸根據(jù)2015 年版《中國藥典》 處方自制，補(bǔ)骨脂、肉豆蔻、五味子、吳茱萸、大棗比例為4 ∶2 ∶2 ∶1 ∶2，上述藥材用10 倍量75% 乙醇浸泡30 min，回流提取2 h，濾渣再加8 倍量75%乙醇回流提取1 h，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，-20 ℃下保存，1 100 g 藥材濃縮至785 mL，即每1 mL 藥液含1.4 g 原藥材（分別含補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、五味子醇甲1.60、1.36、0.65 mg）。甲醇、乙腈購自德國Merck 公司；水為超純水。

1.3 動(dòng)物 SD 大鼠，雄性，12 只，體質(zhì)量（190±10）g，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （蘇） 2019-0001。實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，保持12 h 晝夜節(jié)律，室溫（22±2） ℃，自由攝食飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜、質(zhì)譜條件 ACE Excel 3 C18-PFP 色譜柱（100 mm×3.0 mm）；流動(dòng)相乙腈-0.1% 甲酸（36 ∶64）；體積流量500 μL／min；柱溫40 ℃；離子源ESI+，多反應(yīng)檢測模式（MRM）；離子源電壓4 000 V；離子源溫度400 ℃。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 各成分質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters for various constituents

2.2 溶液制備 精密稱取補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、五味子醇甲對照品適量，甲醇分別溶解定容至2.07、2.14、2.00 mg／mL，以此為母液，臨用前稀釋。再精密稱取替硝唑適量，配制成100 ng／mL內(nèi)標(biāo)液。

2.3 血漿樣品處理 取100 μL 空白血漿，加入10 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻30 s，加入800 μL 乙酸乙酯，振蕩3 min，12 000 r／min 離心10 min，取700 μL 上清液，40 ℃下離心濃縮，加入100 μL 50%乙腈復(fù)溶，振蕩3 min，12 000 r／min 離心10 min，取5 μL 上清液進(jìn)樣分析。

2.4 造模及血漿樣品采集 大鼠按體質(zhì)量均衡和隨機(jī)的原則分為正常組和模型組，每組6 只，正常組每籠3 只，模型組單籠飼養(yǎng)，并在21 d 內(nèi)接受10 種刺激因子，包括禁食、禁水、潮濕墊料、晝夜顛倒、閃光、4 ℃冰水游泳、熱刺激5 min、束縛應(yīng)激6 h、水平振蕩10 min、觸摸陌生異常物品。確認(rèn)造模成功后，第22 天大鼠禁食不禁水12 h，灌胃給 予四神 丸混懸 液 6.48 g／kg （即4.63 mL／kg），于給藥前及給藥后5、15、30、45、60、90、120、180、240、360、480、720、960、1 440 min眼眶取血各約0.3 mL，置于肝素化EP 管中，4 000 r／min 離心10 min，取上層血漿保存于-80 ℃冰箱中待測。

2.5 行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 在造模3 周后開始。

2.5.1 糖水消耗實(shí)驗(yàn) 大鼠在適應(yīng)性期間給予2瓶2%蔗糖溶液適應(yīng)3 d 后，才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。大鼠禁水18 h，每只給予體積相同的1 瓶2%蔗糖溶液和1 瓶純水，測試4 h，其中每2 h 2 瓶水交換位置。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，計(jì)算糖水消耗率，公式為糖水消耗率＝ ［（蔗糖消耗量） ／ （純水消耗量+蔗糖消耗量）］ ×100%。

2.5.2 曠場實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前需提前將大鼠搬入測試室使其適應(yīng)環(huán)境1 h，再放入長、寬、高均為50 cm，內(nèi)壁涂黑的紙箱中心，底面平均分為25個(gè)10 cm×10 cm 的小方格。以5 min 內(nèi)大鼠三爪以上穿越底面的方格數(shù)為水平得分，穿越1 格得1 分；以大鼠雙前肢抬起1 cm 以上次數(shù)為垂直得分，離地一次得1 分。實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行攝像和計(jì)時(shí)。

2.5.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 正式實(shí)驗(yàn)前1 d 大鼠進(jìn)行預(yù)游泳，將其放入（24±2）℃水中并保持懸浮，四肢不能觸及桶底，15 min 后取出，擦干放回籠中，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程保持安靜。次日在相同條件下大鼠強(qiáng)迫游泳5 min，記錄后4 min 內(nèi)不動(dòng)時(shí)間（大鼠僅有頭部露出水面，呈漂浮狀態(tài)，四肢可有微動(dòng)）。

2.5.4 結(jié)果分析 經(jīng)過21 d 造模后，與正常組比較，模型組大鼠糖水消耗率、水平得分、豎直得分降低 （P＜0.05，P＜0.01），不動(dòng)時(shí) 間延長（P＜0.05），顯示造模成功，見表2。

表2 各組大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（， n＝6）Tab.2 Results of behavioral tests for rats in various groups （， n＝6）

表2 各組大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（， n＝6）Tab.2 Results of behavioral tests for rats in various groups （， n＝6）

注：與正常組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 專屬性考察 取空白大鼠血漿、空白大鼠血漿+對照品+內(nèi)標(biāo)（替硝唑）、給藥1 h 后血漿樣品，按“2.3” 項(xiàng)下方法處理，在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、五味子醇甲、內(nèi)標(biāo)（替硝唑） 保留時(shí)間分別為4.72、5.24、7.34、1.5 min，各成分與內(nèi)標(biāo)色譜峰峰形良好而且互不干擾，同時(shí)血漿中雜峰也無干擾，基線平穩(wěn)，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分LC-MS／MS 色譜圖Fig.1 LC-MS／MS chromatograms of various constituents

2.6.2 線性關(guān)系考察 取100 μL 空白大鼠血漿，加入對照品、內(nèi)標(biāo)溶液各10 μL，按“2.3” 項(xiàng)下方法處理，在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定。以各成分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)（Y），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸，以S／N≥10為最低定量限，結(jié)果見表3，可知各成分在各組范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.6.3 準(zhǔn)確度、精密度試驗(yàn) 取100 μL 空白大鼠血漿，制成低、中、高3 個(gè)質(zhì)量濃度的樣品（補(bǔ)骨脂素3.2、80、1 200 ng／mL，異補(bǔ)骨脂素1.6、40、600 ng／mL，五味子醇甲0.32、8、120 ng／mL），按“2.3” 項(xiàng)下方法處理，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，連續(xù)3 d，結(jié)果見表4，可知該方法準(zhǔn)確度、精密度良好。

表4 各成分準(zhǔn)確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of accuracy，precision and matrix effect tests for various constituents

2.6.4 基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn) 精密加入低、中、高質(zhì)量濃度對照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液各10 μL，復(fù)溶到80 μL，振蕩3 min，12 000 r／min 離心10 min，取上清液5 μL，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，峰面積為A1；按“2.3” 項(xiàng)下方法提取空白血漿（不加內(nèi)標(biāo)），離心濃縮后同法操作，峰面積為A2，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，公式為基質(zhì)效應(yīng)＝A2／A1×100%，結(jié)果見表4，可知內(nèi)源性物質(zhì)對3 種成分無影響。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取100 μL 空白大鼠血漿，按“2.6.3” 項(xiàng)下方法制成低、中、高3 個(gè)質(zhì)量濃度的樣品各3 份，分別在室溫下放置12 h、-20 ℃下反復(fù)凍融3 次、-80 ℃下保存30 d 后，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、五味子醇甲峰面積RSD 分別為0.99%～5.16%、1.09%～4.78%、0.90%～4.24%，表明該方法穩(wěn)定性良好，符合生物樣品分析要求。

2.6.6 提取回收率 取100 μL 空白大鼠血漿，按“2.6.3” 項(xiàng)下方法制成低、中、高3 個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，各5 份，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，峰面積為A3，計(jì)算提取回收率，公式為提取回收率＝A3／A2×100%。結(jié)果，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、五味子醇甲提取回收率分別為66.33%～70.28%、61.28%～74.45%、61.93%～68.16%。

2.7 藥動(dòng)學(xué)研究 各成分在正常大鼠、抑郁大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2，經(jīng)DAS1.0 軟件處理分析后主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表5。由此可知，各成分藥動(dòng)學(xué)均符合一室模型；與正常組比較，模型組各成分Cmax、AUC0～t升高（P＜0.05，P＜0.01），以異補(bǔ)骨脂素更明顯。

圖2 各成分血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.2 Plasma concentration-time curves for various constituents

表5 各成分主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（， n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for vairous constituents （， n＝6）

表5 各成分主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（， n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for vairous constituents （， n＝6）

注：與正常組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在測定大鼠血漿中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、五味子醇甲含有量時(shí)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素是同分異構(gòu)體，質(zhì)荷比相同，質(zhì)譜無法區(qū)分，故應(yīng)用液相色譜將兩者分離開。在考察流動(dòng)相時(shí)發(fā)現(xiàn)，乙腈作為有機(jī)相峰形和出峰時(shí)間較好，而0.1%甲酸作為水相同分異構(gòu)體峰形良好。再通過考察不同型號(hào)和品牌色譜柱，確定ACE Excel 3 C18-PFP色譜柱（100 mm×3.0 mm） 能滿足分析要求。

在血漿樣本處理過程中，本實(shí)驗(yàn)考察了蛋白沉淀（甲醇、乙腈、10% 三氯乙酸） 和液液萃?。ㄒ宜嵋阴?、丙酮、二氯甲烷），發(fā)現(xiàn)甲醇、乙腈蛋白沉淀的提取回收率與乙酸乙酯萃取的相近，且后者萃取后能明顯減少血漿樣本內(nèi)源性物質(zhì)干擾，提高基質(zhì)效應(yīng)，故選擇乙酸乙酯萃取作為前處理方法。

不同文獻(xiàn)報(bào)道的補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素藥動(dòng)學(xué)參數(shù)并不一致［15］，其原因可能是本實(shí)驗(yàn)采用75%乙醇作為提取溶劑，而文獻(xiàn)采用水煎煮法，提取出來成分相差較大，給藥劑量也有所差異。與正常組大鼠比較，模型組補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、五味子醇甲t1／2無明顯差異；異補(bǔ)骨脂素、五味子醇甲Tmax無明顯差異，而補(bǔ)骨脂素Tmax高于正常組；3種成分在抑郁大鼠體內(nèi)的Cmax分別為在正常大鼠體內(nèi)的1.36、1.30、1.47 倍，AUC0～t分別為1.38、1.27、1.40 倍，AUC0～∞分別為1.38、1.26、1.33倍，表明各成分吸收程度在抑郁大鼠體內(nèi)明顯提高，而消除速度無明顯變化，其原因可能是疾病狀態(tài)導(dǎo)致其吸收過程發(fā)生改變［16-17］。綜上所述，大鼠在抑郁狀態(tài)下四神丸中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、五味子醇甲血藥濃度明顯改變，對臨床上抑郁癥患者用藥量具有一定參考意義。