吳曉東，黃閏月，陳秀敏，王茂杰，趙 越，伍嘉琪

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州510006； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州510405）

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA） 是一種以關(guān)節(jié)軟骨病變，滑膜細(xì)胞增生為特征的系統(tǒng)性、炎性自身免疫性疾?。?］。目前認(rèn)為免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)失衡是RA 發(fā)病過(guò)程的核心免疫機(jī)制［2］，其中自身反應(yīng)性T 細(xì)胞在RA 免疫紊亂中起著關(guān)鍵作用［3］。由于RA 的難治性和機(jī)制的復(fù)雜性，現(xiàn)有方案的治療效果仍有待進(jìn)一步改善［4］，因此，RA 治療藥物的研發(fā)仍然迫切。中醫(yī)藥治療RA 效果顯著，但是很多有效藥物的機(jī)制仍然不明，限制了其臨床廣泛應(yīng)用。通迪膠囊是純中藥制劑，具有活血行氣、散瘀止痛的功效，被廣泛用于各種風(fēng)濕關(guān)節(jié)病。本研究以Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠為研究對(duì)象，探討通迪膠囊對(duì)CIA 小鼠關(guān)節(jié)炎癥與細(xì)胞免疫功能的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)雌性BALB／c 小鼠29 只，6～8 周齡，體質(zhì)量（20±2） g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （京） 2016-0006。

1.2 藥物與試劑 通迪膠囊（批號(hào)20170714，貴州景誠(chéng)制藥有限公司）；雞Ⅱ型膠原 （批 號(hào)120257，美 國(guó)Chondrex 公司）；弗氏完全佐劑 （批號(hào)SLBT1714，美國(guó)Sigma 公司）；PE 偶聯(lián)小鼠CD4 抗體（批號(hào)7312859，美國(guó)BD 公 司）；Mouse Th1／Th2／Th17 Phenotyping Kit （批 號(hào)8019831，美 國(guó)BD 公 司）；Transcription Factor Buffer Set（批號(hào)7282590，美 國(guó)BD 公 司）；甲氨蝶呤片 （批 號(hào)036170502，上海上藥信誼藥廠有限公司）。

2 方法

2.1 造模 選用BALB／c 小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，雞Ⅱ型膠原溶解于0.1 mol／L 冰醋酸中，使其終質(zhì)量濃度為2 mg／mL，4 ℃過(guò)夜，次日，將溶解的膠原與等體積弗氏完全佐劑充分乳化（冰上操作） 至油包水狀，使膠原濃度為1 mg／mL；初次免疫時(shí)，于BALB／c 小鼠足底皮下和尾根部皮下2～3 cm 處注射100 μL 乳化膠原；2 周后，以相同劑量再次加強(qiáng)免疫，肉眼觀察小鼠四肢，每隔3 d 采用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠左右后足踝關(guān)節(jié)下0.5 mm 處的直徑值，作為關(guān)節(jié)腫脹度的指標(biāo)。

2.2 分組、給藥 根據(jù)動(dòng)物的存活率和模型成功率，將以上造模成功Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠隨機(jī)分為模型組（5 只）、甲氨蝶呤組（8 只），通迪膠囊組（11 只），另設(shè)空白組5 只。各組動(dòng)物于第1 次免疫第16 天后，通迪膠囊組灌胃給予通迪膠囊溶液0.55 g／kg，1 d／次；甲氨蝶呤組每周灌胃給予2 次甲氨蝶呤溶液2.055 mg／kg；空白組、模型組每天給予生理鹽水；連續(xù)給藥50 d。給藥劑量按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人臨床用藥量的換算公式計(jì)算得出。

2.3 腫脹度的測(cè)定 根據(jù)參考文獻(xiàn)［5］，每隔3 d采用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠左右后足踝關(guān)節(jié)下0.5 mm 處的直徑值，作為關(guān)節(jié)腫脹度的指標(biāo)。

2.4 細(xì)胞因子檢測(cè) 給藥50 d 后，采用毛細(xì)管眼球取血。離心收集血清（3 500 r／min、4 ℃、15 min），凍存于-80 ℃待測(cè)。以上樣品均采用ELISA 法檢測(cè)CRP、TNF-α 水平。

2.5 關(guān)節(jié)組織病理檢查 根據(jù)參考文獻(xiàn)［6］，給藥50 d后，頸椎脫臼處死小鼠，除去病變關(guān)節(jié)的皮毛和多余的組織，保留跖趾關(guān)節(jié)及趾間關(guān)節(jié)，4% 多聚甲醛固定，10%EDTA 脫鈣，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片。HE 染色，加封玻片保存，顯微鏡下觀察。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1、Th2、Th17、Treg 淋巴細(xì)胞 給藥50 d 后，脫頸處死小鼠后置于75% 酒精中浸泡5 min殺菌，開(kāi)腹，立即取出脾臟，研磨，分離脾淋巴細(xì)胞，加入1 mL 紅細(xì)胞裂解液，輕彈，室溫下靜置5 min，1 000g離心5 min，將制備的脾臟單細(xì)胞懸浮于RPMI 1640 （含10%熱滅活FBS），細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106／mL。分別取200 μL 細(xì)胞加入到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。加入250×的PMA＆離子霉素工作液0.8 μL，混勻。37 ℃孵育1 h，加入高爾基阻斷劑0.13 μL，繼續(xù)孵育6 h，期間混勻3 次。收集細(xì)胞于流式管中，加入相應(yīng)抗體，上機(jī)檢測(cè)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以（） 表示；多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)兩兩比較采用LSD 法，方差不齊時(shí)兩兩比較采用Tamhane’s T2 法。以P≤0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠踝關(guān)節(jié)一般狀態(tài) 經(jīng)完全弗氏佐劑和雞Ⅱ型膠原誘導(dǎo)后第3 天，造模小鼠開(kāi)始出現(xiàn)關(guān)節(jié)及足趾輕微腫脹，食欲減退，精神差，體質(zhì)量下降情況；在第15 天進(jìn)行2 次免疫后關(guān)節(jié)腫脹程度加重，行動(dòng)不便。

3.2 各組小鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度 如圖1 所示，與空白組相比，模型組、甲氨蝶呤組、通迪膠囊組小鼠自注射雞Ⅱ型膠原蛋白后，左右足關(guān)節(jié)明顯出現(xiàn)腫脹，并在第18 天達(dá)到高峰。經(jīng)給藥后，甲氨蝶呤組、通迪膠囊組的小鼠，左右足的腫脹度下降。

圖1 各組小鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度

3.3 各組小鼠細(xì)胞因子水平 如圖2～3 所示，與空白組比較，模型組CRP、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，甲氨蝶呤組、通迪膠囊組的CRP、TNF-α 水平降低（P＜0.05）。通迪膠囊與甲氨蝶呤組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 各組小鼠CRP 水平

圖3 各組小鼠血清因子TNF-α 水平

3.4 各組小鼠踝關(guān)節(jié)HE 染色 如圖4 所示，空白組各關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)較清晰正常，關(guān)節(jié)腔內(nèi)干凈，關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)正常，滑膜未見(jiàn)增生，組織未見(jiàn)明顯炎癥反應(yīng)。模型組局部關(guān)節(jié)可見(jiàn)滑膜增生、骨膜增生，并伴有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；關(guān)節(jié)腔內(nèi)可見(jiàn)較多細(xì)胞結(jié)構(gòu)；組織中還可見(jiàn)多處大量結(jié)締組織增生，并伴有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。甲氨蝶呤組組織中關(guān)節(jié)滑膜未見(jiàn)增生，關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)正常，關(guān)節(jié)腔內(nèi)干凈；組織中可見(jiàn)較多結(jié)締組織增生，但未見(jiàn)明顯炎癥反應(yīng)；通迪膠囊組的組織中關(guān)節(jié)滑膜未見(jiàn)增生，關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)正常，關(guān)節(jié)腔內(nèi)干凈；組織可見(jiàn)較多結(jié)締組織增生（與甲氨蝶呤組相似），并伴有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與空白組比較，模型組病變顯著，主要病變?yōu)榛ぴ錾⒔Y(jié)締組織增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較，甲氨蝶呤組和通迪膠囊組關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)正常，關(guān)節(jié)腔內(nèi)干凈，未見(jiàn)滑膜增生，其中甲氨蝶呤組炎癥反應(yīng)較模型組輕，通迪膠囊組炎癥反應(yīng)較模型組差異不顯著，但癥狀較模型組稍好轉(zhuǎn)，提示通迪膠囊可減輕小鼠關(guān)節(jié)損傷。

3.5 各組小鼠Th1、Th2、Th17 和Treg 淋巴細(xì)胞比例 與空白組比較，模型組Th1、TH17 細(xì)胞比例升高（P＜0.05）；與模型組比較，甲氨蝶呤組、通迪膠囊組的Th1、TH17 細(xì)胞比例降低（P＜0.05）。與空白組比較，模型組TH2、Treg 細(xì)胞比例減少（P＜0.05）；與模型組比較，甲氨蝶呤組和通迪膠囊組的Th2、Treg 細(xì)胞比例升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖5～6。

圖4 各組踝關(guān)節(jié)病理切片（200×）

圖5 流式細(xì)胞圖

與空白組比較，模型組的小鼠脾臟Th 細(xì)胞亞群相對(duì)數(shù)量Th1／Th2、Th17／Treg 比值均上升（P＜0.05）；與模型組比較，甲氨蝶呤組、通迪膠囊組的小鼠脾臟Th 細(xì)胞亞群相對(duì)數(shù)量Th1／Th2、Th17／Treg 比值均下降（P＜0.05）。見(jiàn)圖7。

4 討論

RA 是由自身免疫耐受失衡引起的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，以滑膜炎癥、血管翳形成及關(guān)節(jié)破壞為主要病理特征。RA 確切發(fā)病機(jī)制不明，目前認(rèn)為T(mén)h 亞型 （Th1、Th2、Th17、Treg） 間的相互作用及平衡在RA 的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［7］。當(dāng)平衡向Th1 和Th17 型細(xì)胞傾斜時(shí)，導(dǎo)致Th1 和Th17 型細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-17 等炎性細(xì)胞因子亢進(jìn)，而Th2 和Treg 型抗炎細(xì)胞因子如IL-4 和TGF-β 產(chǎn)生不足，機(jī)體內(nèi)穩(wěn)定的免疫內(nèi)環(huán)境遭到破壞，引起局部或全身免疫應(yīng)答失常，導(dǎo)致RA 的疾病進(jìn)展，由此可見(jiàn)RA 的轉(zhuǎn)歸依賴(lài)于Th 細(xì)胞亞型及其相關(guān)細(xì)胞因子的變化［8］。研究表明，Th17 細(xì)胞產(chǎn)生具有強(qiáng)大致炎效應(yīng)的IL-17、TNF-α，通過(guò)誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs） 和破骨細(xì)胞的生成，促進(jìn)關(guān)節(jié)滑膜的炎癥反應(yīng)及軟骨破壞［9］；而Treg 細(xì)胞可以產(chǎn)生抑制性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β、IL-35，并通過(guò)上調(diào)抑制性免疫細(xì)胞表面分子表達(dá)和下調(diào)活化T 細(xì)胞的相關(guān)基因，抑制靶細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答［10］。Treg、Th17 細(xì)胞在特定的細(xì)胞因子微環(huán)境下可以相互轉(zhuǎn)換，初始CD4+T 細(xì)胞在TGF-β單獨(dú)作用下分化為T(mén)reg 細(xì)胞，而當(dāng)TGF-β 和IL-6 共同存在時(shí)，能夠誘導(dǎo)RORγt 的表達(dá)，促進(jìn)初始T 細(xì)胞分化為T(mén)h17細(xì)胞［11］。因此，調(diào)節(jié)Th1、Th2、Th17 和Treg 細(xì)胞間的平衡可成為治療RA 的新方法。

本研究采用雞Ⅱ型膠原誘導(dǎo)BALB／c 小鼠關(guān)節(jié)炎模型，在發(fā)病機(jī)制、疾病癥狀和病理特征上與RA 都具有共同點(diǎn)，是研究人類(lèi)RA 較為經(jīng)典、成熟的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，在國(guó)際上廣泛應(yīng)用于治療RA 藥效評(píng)價(jià)和作用機(jī)制的研究［12］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)通迪膠囊干預(yù)后的CIA 小鼠關(guān)節(jié)腫脹度明顯降低，提示了該藥的抗炎效果。CIA 小鼠模型與人RA 相似，細(xì)胞免疫和體液免疫變化明顯，可表達(dá)TNF-α、CRP 等促炎細(xì)胞因子，ELISA 結(jié)果表明通迪膠囊能夠顯著的降低CRP 和TNF-α 血清因子水平，進(jìn)一步證明了通迪膠囊的抗炎作用。病理切片的研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，雖然在通迪膠囊給藥組的CIA 小鼠踝關(guān)節(jié)組織內(nèi)有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但較模型組輕，重要的是組織細(xì)胞排列相對(duì)整齊，血管翳生成減少，關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)正常，說(shuō)明了通迪膠囊不僅具有炎癥抑制作用，更可以保護(hù)CIA 小鼠的關(guān)節(jié)軟骨，具有較好的骨保護(hù)作用。

RA 的骨質(zhì)破壞進(jìn)程是該病致殘的主要原因，目前的西醫(yī)常規(guī)治療策略無(wú)法有效抑制RA 骨破壞進(jìn)程，而新型藥物如生物模擬物對(duì)骨破壞是否具有有效抑制作用仍有待進(jìn)一步的研究觀察［13］。本研究中，通迪膠囊對(duì)CIA 小鼠血管翳生成的抑制作用及對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用提示了該藥作為RA 骨保護(hù)藥物的開(kāi)發(fā)價(jià)值，是中藥復(fù)方治療作用的一個(gè)亮點(diǎn)，值得重視和深入挖掘。

為了進(jìn)一步探討通迪膠囊治療關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，本研究結(jié)合RA 的免疫學(xué)機(jī)制，進(jìn)一步探索了通迪膠囊對(duì)CIA小鼠脾臟Th1、Th2、Th17 和Treg 淋巴細(xì)胞的影響。在Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型中Th1／Th2、Th17／Treg 細(xì)胞的比例及其分泌的細(xì)胞因子較空白實(shí)驗(yàn)組明顯升高，表明在Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎形成中Th 處于高度活化狀態(tài)，這與RA的研究結(jié)果報(bào)道一致［14-15］。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)通迪膠囊灌胃給藥能夠升高Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠Th2 和Treg 細(xì)胞的水平，同時(shí)下調(diào)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠的Th1 和Th17的水平，從而調(diào)節(jié)Th1、Th2、Th17、Treg 功能性細(xì)胞間的相互作用，誘導(dǎo)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠產(chǎn)生免疫耐受。另一方面經(jīng)過(guò)給藥后Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠的Th1／Th2 與Treg／Th17 細(xì)胞比例下降，提示通迪膠囊通過(guò)調(diào)控Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠脾臟Th1／Th2、Th17／Treg 細(xì)胞比例失衡，重新誘導(dǎo)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠的免疫平衡，從而達(dá)到治療疾病的目的。鑒于Th17 活化在其他自身免疫病中的重要作用，以及新上市的針對(duì)IL-17 的生物制劑在銀屑病關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎治療中的顯著療效［16-17］，通迪膠囊在其他自身免疫病治療中的應(yīng)用價(jià)值值得進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究表明通迪膠囊對(duì)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠的抗炎和骨保護(hù)作用，并探討了其免疫學(xué)的機(jī)制與調(diào)控Th1／Th2、Th17／Treg 失衡有關(guān)。研究結(jié)果進(jìn)一步提示了通迪膠囊對(duì)自身免疫病的治療作用，值得深入開(kāi)展機(jī)制研究和臨床觀察。