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HPLC 法同時(shí)測定華佗救心丸中8 種蟾蜍二烯內(nèi)酯

2020-06-02 09:31周文莉祝宇龍李龍飛闞家義
中成藥 2020年5期
關(guān)鍵詞:蟾酥乙腈供試

周文莉,祝宇龍,李龍飛,趙 冰,彭 燦?,闞家義

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥230012; 2.華佗國藥股份有限公司,安徽 亳州236800; 3.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院,安徽 合肥230051)

蟾酥是蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍或黑框蟾蜍耳后腺及表皮腺體的分泌物,白色乳狀液體或淺黃色漿液[1],是我國常用的一味傳統(tǒng)名貴中藥,主要含有蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類[2-3]、蟾毒色胺類、甾醇類等成分,以蟾酥二烯內(nèi)酯類為主。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[4-7],蟾酥有增強(qiáng)心肌收縮力、麻醉、降壓、抗炎、抗腫瘤、抗輻射、抑制血小板聚集、增加冠狀動(dòng)脈血流等藥理活性,但其毒性也大,用藥不當(dāng)會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)[8-10],故對其服用劑量有嚴(yán)格要求。

華佗救心丸由蟾酥、人參莖葉總皂苷、牛膽膏粉、人工麝香、珍珠、人工牛黃、冰片、三七膏粉組成[11-13],其執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn).中藥成方制劑》 第十九冊(標(biāo)準(zhǔn)文號WS3-B-3675-98),但目前大多以單一或幾種成分含有量為指標(biāo)來表征其質(zhì)量[14-16],存在操作繁瑣、時(shí)間長、檢測不全面、成本高等缺點(diǎn),故有必要研究開發(fā)一種簡便快捷、全面準(zhǔn)確的含量測定方法。因此,本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測定華佗救心丸中華蟾酥毒基、酯蟾毒配基、日蟾毒它靈、蟾毒靈、沙蟾毒精、蟾毒它靈、遠(yuǎn)華蟾毒精、華蟾毒它靈的含有量,以期對該制劑質(zhì)量進(jìn)行有效控制。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2489 高效液相系統(tǒng) (美國Waters 公司);YL-060S 超聲波清洗器(深圳市語路清洗設(shè)備有限公司,360 W,40 kHz);電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京) 有限公司];離心機(jī)(常州市萬豐儀器制造有限公司)。

1.2 試劑與藥物 酯蟾毒配基、華蟾酥毒基、日蟾毒它靈、蟾毒靈、沙蟾毒精、蟾毒它靈、遠(yuǎn)華蟾毒精、華蟾毒它靈對照品(純度≥98%),均購于成都克洛瑪生物科技有限公司。華佗救心丸(批號201901、201902、201903、201904、201905),由華佗國藥股份有限公司提供。乙腈購于西格瑪奧德里奇(上海) 貿(mào)易有限公司;甲醇購于北京百靈威科技有限公司;乙醇購于上海潤捷化學(xué)試劑有限公司;水為超純水 (美國Pall 公司純水機(jī)制備)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Thermo Scientific C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相水(A) -乙腈(B),梯度洗脫 (0~2 min,20%~38% B;2~5 min,38%~56% B;5~19 min,56%~66% B;19~19.1 min,66%~20% B;19.1~20 min,20%B);體積流量0.6 mL/min;檢測波長296 nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取遠(yuǎn)華蟾毒精、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基、日蟾毒它靈、蟾毒靈、沙蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒它靈對照品適量,甲醇制成1 mg/mL 貯備液,吸取適量,甲醇稀釋,即得(0.1 mg/mL)。

2.2.2 供試品溶液 取5 批丸劑,研細(xì),每批取約0.3 g,精密稱定,精密加入20 mL 甲醇,室溫下超聲處理20 min 后取出,冷卻,甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,振蕩搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 精密量取“2.2” 項(xiàng)下對照品、供試品溶液各10 μL,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,結(jié)果見圖1。由此可知,各成分色譜峰與其前后峰的分離度均大于1.5,理論塔板數(shù)以蟾毒靈峰計(jì)為3 000,其他成分對測定無干擾。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下貯備液適量于量瓶中,甲醇稀釋至刻度,振蕩搖勻,制成質(zhì)量濃度為5、10、25、50、100 μg/mL的系列溶液,精密吸取適量,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X) 進(jìn)行回歸,結(jié)果見表1,可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下對照品溶液10 μL,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次,測得日蟾毒他靈、沙蟾毒精、遠(yuǎn)華蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基峰面積RSD 分別為0.41%、0.43%、0.42%、0.43%、0.41%、0.44%、0.52%、0.51%,表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號201901) 適 量,于2、4、6、12、24、48 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,測得日蟾毒他靈、沙蟾毒精、遠(yuǎn)華蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基峰面積RSD 分別為0.54%、0.52%、0.45%、0.58%、0.46%、0.60%、0.65%、0.61%,表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constitutents

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取丸劑(批號201901) 適量,按“2.2.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,測得日蟾毒他靈、沙蟾毒精、遠(yuǎn)華蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基峰面積RSD 分別為 2.35%、3.47%、3.59%、2.84%、1.46%、1.67%、0.27%、0.49%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取丸劑(批號201901) 適量,共6 份,加入“2.2.1” 項(xiàng)下貯備液適量,按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,計(jì)算回收率。結(jié)果,日蟾毒他靈、沙蟾毒精、遠(yuǎn)華蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基平均加樣回收率分別 為 98.54%、95.07%、97.45%、99.58%、100.46%、102.59%、98.65%、97.61%,RSD 分別為2.75%、2.46%、1.53%、2.81%、1.42%、1.60%、2.03%、2.19%。

2.3.7 樣品含有量測定 取5 批丸劑,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,計(jì)算含有量,結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 提取溶劑、提取時(shí)間篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了不同提取溶劑(甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇)、提取時(shí)間(10、20、40、60 min) 對提取效果的影響,發(fā)現(xiàn)以甲醇為提取溶劑超聲提取20 min 時(shí),蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分提取效率最高。

表2 各成分含有量測定結(jié)果(mg/g, n=3)Tab.2 Results of content determination of various constituents (mg/g, n=3)

3.2 色譜條件篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了Unitary C18、Thermo Scientific C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm) 的分離效果,發(fā)現(xiàn)后者更理想。然后,考察了不同柱溫(25、30、35、40 ℃),發(fā)現(xiàn)30 ℃時(shí)分離效果最佳。

3.3 流動(dòng)相篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了0.15% 磷酸-乙腈、0.5% 甲酸-乙腈、水-乙腈的分離效果,發(fā)現(xiàn)以水-乙腈為流動(dòng)相時(shí)色譜峰峰形較好,并且為非酸性溶液,對儀器損害較小,并按“2.1” 項(xiàng)下比例梯度洗脫,此時(shí)各成分色譜峰分離度均大于1.5,而且峰形完整。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)所采用的HPLC 法具有簡便、快速、穩(wěn)定、精密度和重復(fù)性良好的優(yōu)點(diǎn),能在同一色譜條件下同時(shí)測定華佗救心丸中華蟾酥毒基、酯蟾毒配基、日蟾毒它靈、蟾毒靈、沙蟾毒精、蟾毒它靈、遠(yuǎn)華蟾毒精、華蟾毒它靈的含有量,不僅能有效鑒別該制劑中蟾酥微量成分的有無,也可對其含有量進(jìn)行全面準(zhǔn)確的檢測,以期為相關(guān)質(zhì)量控制提供重要保障[17-19]。

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