李金鑫，張京華，陳 達，李利芬，孟兆青

（山東宏濟堂制藥股份集團有限公司，山東省中藥質(zhì)量控制技術重點實驗室，山東 濟南250100）

喉癥丸為水丸，由板藍根、人工牛黃、冰片、豬膽汁、玄明粉、青黛、雄黃、硼砂（煅）、蟾酥（酒制）、百草霜10 味藥材組成［1］，用于治療咽炎、喉炎、扁桃腺炎、一般瘡癤。目前該方執(zhí)行衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第四冊質(zhì)量標準（WS3-B-0848-91），但缺少含有量測定和溶出度檢查項，無法以標志成分含有量變化為指標來評判泛制法改為塑制法時，是否會對產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生影響。蟾酥作為喉癥丸毒性藥材，其所含成分的量與制劑有效性和安全性密切相關［2］。為了對喉癥丸生產(chǎn)工藝泛制法改為塑制法進行可行性評價，本實驗測定蟾酥中華蟾酥毒基、脂蟾毒配基溶出度，比較2 種工藝溶出曲線相似性，對所得樣品進行一致性評價，以期為企業(yè)優(yōu)化相關生產(chǎn)提供質(zhì)量控制的方法和依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agileht 公司）；XS105 電子分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］；ZRS-8G 智能溶出試驗儀 （天津天大天發(fā)科技有限公司）；Agilent ZORBAX-RP （250 mm×4.6 mm，5 μm）、Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm） 色譜柱。

1.2 試劑與藥物 華蟾酥毒基（批號110803-201406，純度99.6%）、脂蟾毒配基（批號110718-201108，純度98.9%） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。喉癥丸由山東宏濟堂制藥集團股份有限公司生產(chǎn)，共6 批，其中批號1709001、1709002、1709003 為泛制丸，批號ZS1803003、ZS1803004、ZS1803005 為塑制丸。甲醇、乙腈均為色譜純，購自德國默克公司；磷酸為色譜純，購自天津光復化學試劑有限公司；甲醇為分析純，購自天津富宇化工有限公司；鹽酸、醋酸鈉、冰醋酸、氯化鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、十二烷基硫酸鈉（SDS） 均為分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶出度測定

2.1.1 色譜條件 填充劑十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相乙腈-0.2% 磷酸 （46 ∶ 54）；體積流量1.0 mL／min；柱溫23 ℃；檢測波長296 nm；進樣量20 μL （進樣量10 μL 時響應值較小，故選擇20 μL）。理論塔板數(shù)按華蟾酥毒基峰計算，應不低于5 000。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取對照品華蟾酥毒基11.07 mg、脂蟾毒配基10.11 mg，甲醇溶解并定容至25 mL，搖勻，即得（母液中含華蟾酥毒基0.441 0 mg／mL、脂蟾毒配基0.400 0 mg／mL）。

2.1.3 供試品溶液制備 將適量本品研細，取約0.090 0 g （相當于20 粒質(zhì)量） 于錐形瓶中，精密稱定，加入100 mL 水，超聲提取60 min，放冷，補重，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 系統(tǒng)適應性考察 取空白溶劑、對照品（取“2.1.2” 項下母液適量，加水稀釋成含華蟾酥毒基 1.107 0 μg／mL、脂蟾毒配基0.809 9 μg／mL）、供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，華蟾酥毒基、脂蟾毒配基分離度均大于1.5，空白溶劑無干擾，表明該方法系統(tǒng)適應性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of various constituents

2.1.5 線性關系考察 分別精密量取“2.1.2”項下華蟾酥毒基對照品溶液25、125、250、500、1 000 μL 于100 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過；分別精密量取“2.1.2” 項下脂蟾毒配基對照 品溶液 12.5、62.5、125、250、500、1 000 μL于100 mL 量瓶中，0.2%SDS 溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，在“2.1.1” 項色譜條件下各進樣20 μL 測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，得方程分別為華蟾酥毒基Y＝13.557X+0.430 5 （r＝0.999 7）、脂蟾毒配基Y＝14.958X+0.059 5 （r＝0.999 8），分別在0.11～4.43、0.05～4.00 μg／mL 范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.6 精密度試驗 取同一供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得華蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰面積RSD 分別為0.52%、0.35%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、18、24 h，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得華蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰面積RSD 分別為0.74%、0.69%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 重復性試驗 按“2.1.3” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得華蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰面積RSD 分別為0.35%、0.69%，表明該方法重復性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 取同一批含有量已知的丸劑粉末（批號1709003） 約0.045 0 g （相當于10 粒質(zhì)量），精密稱定，加入一定量對照品溶液，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，華蟾酥毒基、脂蟾毒配基平均加樣回收率分別為96.31%、95.16%，RSD 分別為1.64%、1.45%。

2.2 溶出方法篩選 每粒喉癥丸含華蟾酥毒基、脂蟾毒配基總量很低，僅為14.29 μg。在一般制劑溶出度的測定方法中，溶出介質(zhì)量為100～900 mL，但最終測定溶液質(zhì)量濃度僅約為0.016 0 μg／mL，達不到定量限，故選擇每天最大服用量（20 丸），此時溶出介質(zhì)量為100 mL，按照2015 年版《中國藥典》 四部溶出度測定法第三法（小杯法） 來測定溶出度。

2.3 溶出介質(zhì)制備

2.3.1 水 純化水。

2.3.2 pH 6.8 磷酸鹽緩沖液 取0.2 mol／L 磷酸二氫 鉀250 mL，加0.2 mol／L 氫氧化 鈉溶液118 mL，加水稀釋至1 000 mL，搖勻，即得［3］。

2.3.3 0.2%、0.5%、1.0%SDS 溶液 分別稱取SDS 2、5、10 g，加水溶解并稀釋至1 000 mL，搖勻，即得。

2.4 樣品溶液制備 以“2.3” 項下溶出介質(zhì)為溶劑，體積100 mL，轉(zhuǎn)速75 r／min，待其溫度恒定在（37±0.5）℃后取20 粒丸劑，于5、10、15、30、45、60、90、120、150、180 min，各 取2 mL 溶 液，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。取樣至濾過應在30 s內(nèi)完成［4］，并補加同體積、同溫度溶出介質(zhì)。

2.5 溶出介質(zhì)篩選 另取丸劑適量，研細，取約0.090 0 g （相當于20 粒的質(zhì)量），精密稱定，置于錐形瓶中，加入 “2.3” 項下溶出介質(zhì)各100 mL，超聲處理60 min，放冷，溶出介質(zhì)補足減失的質(zhì)量，取續(xù)濾液；精密移取“2.1.2” 項下母液，用對應溶出介質(zhì)稀釋成含華蟾酥毒基1.107 0 μg／mL、脂蟾毒配基0.809 9 μg／mL，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖2～3。由此可知，溶出介質(zhì)為0.2% SDS 溶液時溶出效果較好，120 min 內(nèi)溶出度均達到80%以上。

圖2 華蟾酥毒基在5 種溶出介質(zhì)中的的溶出曲線Fig.2 Dissolution curves for cinobufagin in five dissolution media

圖3 脂蟾毒配基在5 種介質(zhì)中的溶出曲線Fig.3 Dissolution curves for resibufogenin in five dissolution media

2.6 溶出度測定 取泛制法（1709001、1709002、1709003）、塑制法 （ZS1803003、ZS1803004、ZS1803005） 所得樣品各3 批，以0.2% SDS 溶液為溶出介質(zhì)，在 “2.1.1” 項色譜條件下，按“2.5” 項下方法測定，結(jié)果見表1，可知均符合根據(jù)溶出曲線類型和溶出情況所擬訂的限度（120 min 內(nèi)華蟾酥毒基、脂蟾毒配基溶出度都應不少于75%）。

表1 各成分溶出度測定結(jié)果（120 min）Tab.1 Results of dissolution rate determination of various constituents （120 min）

根據(jù)相關規(guī)定［4］，溶出曲線相似性的比較采用非模型依賴法中的差異因子（f1）、相似因子（f2） 法，其中前者計算2 條溶出曲線在每1 個時間點的差異，后者衡量2 條溶出曲線的相似度［5］。一般情況下，當2 條溶出曲線f1小于15，f2不小于50 時，可認為兩者相似［6］。

本實驗在5、10、15、30、45、60、90、120、150、180 min 取樣后進行測定，繪制溶出曲線，分析相似性，結(jié)果見圖4～5、表2～3，由此可知，塑制丸所得3 批產(chǎn)品f1均小于15，f2均大于50，表明該工藝溶出曲線與泛制丸相似。

圖4 塑制丸中華蟾酥毒基溶出曲線Fig.4 Dissolution curves for cinobufagin in plastic-made pills

圖5 塑制丸中脂蟾毒配基溶出曲線Fig.5 Dissolution curves for resibufogenin in plasticmade pills

3 討論

華蟾酥毒基、脂蟾毒配基是喉癥丸中蟾酥主要有效成分，與該方臨床療效確切相關。因此，本實驗選擇上述2 種成分作為指標進行溶出度研究，能客觀真實地反映喉癥丸質(zhì)量和溶出情況，并為相關應用提供參考。

本實驗在篩選溶出介質(zhì)時，分別考察了喉癥丸在0.1 mol／L 鹽酸、pH 4.5 醋酸鹽緩沖液中的溶出情況，發(fā)現(xiàn)華蟾酥毒基、脂蟾毒配基在這2 種溶劑體系下均不穩(wěn)定，含有量會隨時間延長而減小，無法有效測定，故未繪制溶出曲線［7-8］。溶出曲線結(jié)果顯示，在120、150 min 時連續(xù)2 個取樣點的溶出量達到90% 以上，而且相差小于5%，故在180 min停止試驗［9］。又因為一般普通試劑第一次出現(xiàn)溶出量85%以上，2 個時間點溶出量差在5%以內(nèi)（即平臺期） 時，取前一時間點作為取樣時間點，并將該點溶出量減去15%作為溶出限度［10］，故本實驗規(guī)定取樣點為120 min 時華蟾酥毒基、脂蟾毒配基溶出量都不少于75%，作為溶出限度。

溶出度實驗是評價口服固體制劑內(nèi)在質(zhì)量的一種重要手段［11］。不僅可為建立體內(nèi)外相關性提供基礎數(shù)據(jù)，而且能成為通過體外試驗評價口服固體制劑質(zhì)量穩(wěn)定性和均一性的簡便、有效、可行的方法，對評價制劑批次質(zhì)量、優(yōu)化處方及制備工藝、保證處方工藝等變更前后產(chǎn)品質(zhì)量的一致性有重要作用。本實驗結(jié)果顯示，泛制丸、塑制丸所得產(chǎn)品的溶出曲線相似，表明喉癥丸溶出度并未受工藝變更的影響，進行塑制工藝改進是可行的。

表2 塑制丸中華蟾酥毒基f1、 f2 測定結(jié)果Tab.2 Results of f1 and f2 determination for cinobufagin in plastic-made pills

表3 塑制丸中脂蟾毒配基f1、 f2 測定結(jié)果Tab.3 Results of f1 and f2 determination for resibufogenin in plastic-made pills