趙 霞，張 岳

（南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 南陽473000）

肺炎支原體作為無細(xì)胞壁原核細(xì)胞型生物，可通過呼吸道傳播，入侵機(jī)體后引發(fā)炎癥免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂，伴隨C-反應(yīng)蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、白介素-6 （IL-6）、白介素-8 （IL-8） 等炎癥細(xì)胞因子過度活化，從而發(fā)生肺炎支原體肺炎［1-2］，若不及時(shí)治療，則容易促發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征及多器官功能不全綜合癥等，兒童是肺炎支原體肺炎易感人群。作為一種先天性免疫的病原模式識別受體，Toll 樣受體（TLRs） 具有識別多種病原微生物抗原成分的功能，通過髓樣分化因子88 依賴性途徑和非依賴性途徑進(jìn)行信號傳導(dǎo)并活化NFκB，后者可啟動(dòng)CRP、TNF-α、IL-6、IL-8 等炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫，激發(fā)炎性連鎖反應(yīng)，促進(jìn)病情發(fā)生發(fā)展［3-4］，可知以TLRs、炎癥因子變化相關(guān)的免疫紊亂是病理特點(diǎn)。

西醫(yī)治療肺炎支原體時(shí)，常利用糖皮質(zhì)激素迅速抑制內(nèi)毒素分泌和合成，緩解臨床癥狀，但其不良反應(yīng)明顯，芩白清肺方是根據(jù)南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第二附屬醫(yī)院治療經(jīng)驗(yàn)及文獻(xiàn)報(bào)道制備的院內(nèi)制劑。

本研究考察芩白清肺方聯(lián)合糖皮質(zhì)激素對肺炎支原體肺炎患者的臨床療效，以期為該方臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013 年5 月至2018 年4 月收治于南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科的168 例肺炎支原體患者，隨機(jī)分為對照組（85 例） 和觀察組（83 例）。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者家屬或監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2 材料 紅細(xì)胞裂解液（美國eBioscience 公司）；CRP、TNF-α、IL-6、IL-8 試劑盒均購自上海研生實(shí)業(yè)有限公司。iMARK 型酶標(biāo)儀、GENE Genius 凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；PCR 擴(kuò)增儀（德國Biometra 公司）；MX3000P熒光定量PCR 儀（美國Stratagene 公司）；JM-250 電泳儀（大連捷邁科貿(mào)有限公司）；Du-640 紫外分光光度儀（美國貝克曼庫爾特公司）；Master ScreenTMPAED 肺功能監(jiān)測儀（德國耶格公司）；BJ05-4 血?dú)夥治鰞x（德國拜耳公司）。

1.3 治療手段 2 組患者入院后，立即給予祛痰、結(jié)合、平喘、吸氧等常規(guī)治療，對照組注射甲潑尼龍琥珀酸鈉［輝瑞制藥比利時(shí)公司，國藥準(zhǔn)字H20080284，40 mg／瓶（以甲潑尼龍計(jì)），批號20130302］ 靜脈滴注，48 h 內(nèi)每隔6 h 給藥1 次，每次30 mg／kg，48 h 后改為醋酸潑尼松片（蘭州佛慈制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H62020884，5 mg／片，批號20130501） 口服，劑量1 mg／kg；觀察組在對照組基礎(chǔ)上加用芩白清肺方，組方藥材（黃芩、百部、桔梗、地龍、麥冬、紫苑） 均購自河南省內(nèi)中藥批發(fā)公司，經(jīng)南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校中醫(yī)系吳黎明教授鑒定為正品，取上述藥材各15 g，煎煮2 次，合并煎液，濃縮至200 mL，每天分2 次服用。兩組均連續(xù)給藥5 d。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 肺功能 肺功能監(jiān)測儀檢測肺活量（VC）、用力肺活量（FVC）、1 s 用力呼氣容積（FEV1）、峰值呼氣流速（PEF）、最大呼氣中段流量（MMEF）。

1.4.2 血?dú)?血?dú)夥治鰞x檢測血液pH、PCO2、PO2、HCO-3、血紅蛋白、血氧飽和度、紅細(xì)胞壓積。

1.4.3 炎癥因子 ELISA 法檢測空腹外周血CRP、TNF-α、IL-6、IL-8 水平。

1.4.4 To11 樣受體2 （TLR2）、To11 樣受體4 （TLR4）mRNA 表達(dá) 采用RT-PCR 法檢測。治療前后收集空腹外周血各約5 mL，置于抗凝試管中，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，重懸RPMI-1640 培養(yǎng)基，置于96 孔板中，于37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)60 min 后，Trrizol 法、紫外分光光度計(jì)分別提取并測定外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA 及純度，引物序列見表1，以RNA 為模板，加2.5 mmol／L olig （dT） 18 與莫洛尼氏鼠白血病毒逆轉(zhuǎn)錄酶。TLR2、TLR4 mRNA 擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性120 s，循環(huán)擴(kuò)增，97 ℃變性90 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，35 次循環(huán)，72 ℃延伸10 min，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。采用Imag-proplus 軟件分析條帶，以TLR2、TLR4 與NAPDH的IOD 比值為兩者mRNA 表達(dá)。

表1 引物序列

1.4.5 療效評價(jià) （1） 治愈，治療2 周內(nèi)，呼吸道癥狀、體溫、血象、C 反應(yīng)蛋白（CRP） 均正常；（2） 顯效，體溫有降低趨勢，呼吸道癥狀、血象、CRP 均未完全恢復(fù)；（3） 進(jìn)步，體溫未退，但呼吸道癥狀，血象、CRP 中至少有1 項(xiàng)改善；（4） 無效，體溫未退，呼吸道癥狀，血象、CRP 均未改善，甚至惡化?？傆行剩?［（治愈例數(shù)+顯效例數(shù)+進(jìn)步例數(shù)） ／總例數(shù)］ ×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 17.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（）表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 2 組患者性別比、年齡、病程、發(fā)熱時(shí)間、咳嗽時(shí)間、并發(fā)癥情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。

表1 2 組一般資料比較（）

表1 2 組一般資料比較（）

2.2 肺功能指標(biāo) 治療后，觀察組VC、FVC、FEV1、PEF、MMEF 高于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 2 組肺功能指標(biāo)比較（）

表2 2 組肺功能指標(biāo)比較（）

2.3 血?dú)庵笜?biāo)治療后，觀察組pH、PCO2、PO2、、血氧飽和度、血紅蛋白高于對照組 （P＜0.05），兩組紅細(xì)胞壓積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 2 組血?dú)庵笜?biāo)比較（，1 mmHg＝0.133 kPa）

表3 2 組血?dú)庵笜?biāo)比較（，1 mmHg＝0.133 kPa）

2.4 炎癥因子 治療后，觀察組CRP、TNF-α、IL-6、IL-8水平低于對照組（P＜0.05），見表4。

2.5TLR2、TLR4 mRNA 表達(dá) 治療后，觀察組TLR2、TLR4 mRNA 表達(dá)低于對照組（P＜0.05），見表5、圖1。

表4 2 組炎癥因子比較（）

表4 2 組炎癥因子比較（）

表5 2 組TLR2、 TLR4 mRNA 表達(dá)比較（）

表5 2 組TLR2、 TLR4 mRNA 表達(dá)比較（）

圖1 2 組TLR2、 TLR4 mRNA 表達(dá)

2.6 臨床療效 觀察組總有效率高于對照組（P＜0.05），見表6。

表6 2 組臨床療效比較

3 討論

芩白清肺方是參考國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的芩白清肺濃縮丸組方改造而成，由黃芩、百部、桔梗、地龍、麥冬、紫菀6 味藥材組成，全方共奏清肺之熱毒，可保肺之陰津，降肺之逆氣［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組（單用糖皮質(zhì)激素） 比較，觀察組（芩白清肺方聯(lián)合糖皮質(zhì)激素）肺炎支原體肺炎患者肺功能、氣血指標(biāo)、臨床療效均明顯提高。

LRs 可參與固有免疫與炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生及相關(guān)的信號傳遞過程，其中TLR2、TLR4 是該家族重要成員，可協(xié)同鏈接蛋白髓樣分化因子并識別MP，進(jìn)而激活促炎細(xì)胞因子，開啟適應(yīng)性免疫應(yīng)答。本研究發(fā)現(xiàn)，治療前患者外周血單個(gè)核細(xì)胞表面TLR2、TLR4 mRNA 均呈高表達(dá)，外周血炎癥因子CRP、TNF-β、IL-6、IL-8 亦然，表明它們是病情發(fā)生發(fā)展的病理學(xué)特點(diǎn)［6-7］。

本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組可降低外周血單個(gè)核細(xì)胞表面TLR2、TLR4 mRNA 及炎癥因子表達(dá)，與對照組比較在改善上述免疫紊亂方面效果更顯著，提示芩白清肺方具有調(diào)節(jié)免疫紊亂的作用，可能與其所含的藥材及有效成分相關(guān)。陳文等［8］報(bào)道，黃芩可通過下調(diào)肝肺組織炎癥信號通路中TLR4 蛋白表達(dá)來阻止炎癥信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少反向細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α 表達(dá)來發(fā)揮對內(nèi)毒素血癥大鼠肝肺損傷的保護(hù)作用；黃常新等［9］發(fā)現(xiàn)，含百部、紫菀的養(yǎng)陰清熱及潤肺止咳驗(yàn)方發(fā)揮功效是通過抑制TLR4 信號通路、下調(diào)肺部炎癥因子表達(dá)、阻止或延緩放射性肺損傷發(fā)生發(fā)展所致，其作用與激素相當(dāng)；單進(jìn)軍等［10］研究顯示，桔梗中皂苷、黃酮類化合物可與TLR4 蛋白發(fā)生作用，調(diào)控呼吸道過度炎癥反應(yīng)，改善肺功能，降低咳嗽中樞對刺激反應(yīng)，從而達(dá)到止咳祛痰的作用；曹羽等［11］報(bào)道，含有麥冬的芪冬活血飲對LPS 導(dǎo)致的大鼠急性肺損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制TLR4 mRNA 表達(dá)、抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α 和IL-1β、升高抗炎細(xì)胞因子表達(dá)、糾正炎癥失衡等作用相關(guān)；邢清敏等［12］發(fā)現(xiàn)，含有麥冬的生脈散治療擴(kuò)張型心肌病大鼠的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TLR-4 蛋白水平，從而抑制TLR-4／NF-κB 信號通路反向炎癥因子相關(guān)；文秀華等［13］研究顯示，含有紫菀的補(bǔ)肺湯免煎劑可抑制慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織中TLR2、TLR4 活性，通過My D88 依賴性經(jīng)典途徑來調(diào)節(jié)反向NF-κB 信號通路，改善氣道重塑，并呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。

盡管大量臨床研究尋找中醫(yī)治療肺炎支原體肺炎的方法，以改善預(yù)后，但主要傾向于其療效及安全性，鮮有對相關(guān)機(jī)制的深入考察。本研究在臨床經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上分析芩白清肺方的治療機(jī)制，發(fā)現(xiàn)該方有助于降低TLR2、TLR4 mRNA 表達(dá)，可為相關(guān)中醫(yī)藥治療提供參考。

綜上所述，芩白清肺方聯(lián)合糖皮質(zhì)激素可改善肺炎支原體肺炎患者肺功能、氣血指標(biāo)、免疫紊亂，增強(qiáng)抗病能力，促進(jìn)病情恢復(fù)，降低并發(fā)癥發(fā)生。但芩白清肺方中含有多種中藥成分，發(fā)揮調(diào)節(jié)TLR2、TLR4 mRNA 表達(dá)的機(jī)制可能是各成分協(xié)同作用的結(jié)果，考慮到臨床研究的局限性，今后仍需通過動(dòng)物或離體實(shí)驗(yàn)作進(jìn)一步研究。